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A. BONORA-CENTELLES Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

Evaluación de la actividad de los isoenzimas del P450 (CYP)

Las actividades CYP fueron determinadas en microsomas de te-
jido hepático (6). Para ello, 100 mg de proteína microsomal se incu-
bó durante 15 minutos a 37º C en 300 mL de buffer fosfato 100 mM
a pH 7,4, conteniendo un sistema de regeneración-NADPH (Cl2Mg
5 mM, NADP+ 1 mM, glucosa-6-fosfatasa 10 mM y glucosa-6-fosfa-
tasa deshidrogenasa 0,3 U/mL) y el sustrato apropiado. Las concen-
traciones de sustratos para los diferentes isoenzimas del P450 eva-
luados fueron: 10 µM 7-metoxiresorufina (Molecular probes Europe
BV, Leiden, Holanda) (MROD, CYP1A2), 50 µM cumarina (Sigma,
St. Louis, MO, USA) (CH, CYP2A6), 200 µM diclofenac (Sigma, St.
Louis, MO, USA) (D4OH, CYP2C9), 250 µM clorzoxazona (Sigma,
St. Louis, MO, USA) (C6OH, CYP2E1) y 200 µM testosterona (Sig-
ma, St. Louis, MO, USA) (6b-OHT, CYP3A4).

Los ensayos de actividad en cultivo primario de hepatocitos y
células de hepatoma humano HepG2 se llevaron a cabo mediante
la incubación de las monocapas celulares con sustratos específicos
de cada uno de los isoenzimas del P450 [8 µM 7-etoxiresorufi-
na (Roche, Mannheim, Alemania) (EROD; CYP1A1/2)], 10 µM 7-me-
toxiresorufina (MROD; CYP1A2), 50 µM cumarina (CH; CYP2A6),
15 µM 7-benzoxiresorufina (Roche, Mannheim, Alemania) (BROD;
CYP2B6), 500 µM p-nitrofenol (Sigma, St. Louis, MO, USA) (PN;
CYP2E1) y 250 µM testosterona (TEST; CYP3A4) (7). Las reacciones
se pararon aspirando el medio de incubación y añadiendo una solu-
ción de ß-glucuronidasa/arilsulfatasa (Roche, Mannheim, Alemania)
durante dos horas a 37º C.

El contenido en proteína microsomal o celular fue determinado
por el método de Lowry (8).

Finalmente, la evaluación de la actividad de los isoenzimas del
P450 en los hepatocitos aislados a partir de órganos descartados
para implante se llevó a cabo mediante la incubación durante 30 mi-
nutos a 37º C, de la suspensión celular (1,25 × 106 células/mL) ob-
tenida a partir del aislamiento de hepatocitos de órganos descarta-
dos para implante con diferentes sustratos [fenacetina (Ultrafine,
Manchester, UK) 10 µM (CYP1A2), clorzoxazona 50 µM (CYP2E1),
diclofenac 10 µM (CYP2C9), midazolam (Ultrafine, Manchester, UK)
5 µM (CYP3A4) y cumarina 5 µM (CYP2A6)]. Los metabolitos forma-

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