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VOL. 74 (2), 283-306, 2008 DESARROLLO, ANÁLISIS Y OPTIMIZACIÓN DE MODELOS...

MATERIALES Y MÉTODOS

Obtención de tejido hepático

Los órganos descartados para trasplante (un total de cinco híga-
dos, tres órganos enteros y dos lóbulos) fueron extraídos, transporta-
dos, caracterizados y preparados por la Unidad de Trasplante Hepáti-
co del Hospital La Fe. Las biopsias de tejido hepático se obtuvieron
de donantes cadáver durante el transcurso de una laparotomía tera-
péutica a partir de la cara anterior del segmento III de Couinaud. En
ambos casos los hígados antes de la extracción fueron perfundidos
con solución de preservación Celsior (TmTix-Sangstat, Lyon, Francia)
y mantenidos a 4º C hasta el momento del aislamiento de hepatocitos.
El grado de esteatosis se determinó por un examen patológico. Las
muestras hepáticas destinadas a la preparación de microsomas fueron
congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a –80º C hasta su uso.

Aislamiento de hepatocitos humanos a partir de biopsias
hepáticas quirúrgicas y de órganos o lóbulos enteros

La obtención de hepatocitos a partir de biopsias se realizó me-
diante perfusión enzimática del tejido hepático, tal como ya se ha
descrito en detalle previamente (4). El aislamiento de hepatocitos a
partir de órganos o lóbulos enteros se realizó mediante la adaptación
del procedimiento utilizado para biopsias hepáticas de pequeño ta-
maño (Figura 1).

Los hepatocitos se sembraron en placas recubiertas de una mezcla
de fibronectina y colágeno (fibronectina 1 mg/100 mL, colágeno 3 mg/
100 mL y BSA 10 mg/100 mL en medio DMEM), a una densidad de
8 × 104 células viables/cm². El medio utilizado fue Ham’s F-12/Wil-
liams (1:1) (Gibco BRL, Paisley, UK) complementado con un 2% de
suero de ternera (Gibco BRL, Paisley, UK), penicilina 50 mU/mL,
estreptomicina 50 µg/mL, 0,2% de albúmina bovina sérica, insulina
10–8 M, transferrina 25 µg/mL, etanolamina 65,5 mM, ácido linoléico
7,2 mM, glucosa 17,5 mM, ácido ascórbico, 6,14 mM, y N-omega-ni-
tro-L-arginina metiléster 0,64 mM. A partir de las 24 horas los culti-
vos se mantuvieron en un medio sin suero complementado con hor-

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