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VOL. 73 (2), 453-492, 2007 EFECTO DE LA SUBNUTRICIÓN MATERNA SOBRE EL...
90 minutos, a 37º C y con agitación. Después de la incubación se reco-
ge el sobrenadante que se conserva a –20º C hasta el momento de va-
lorar, mediante RIA, la cantidad de insulina liberada por los islotes.
Para determinar el contenido de insulina, grupos de veinte islotes
fetales primarios son recogidos en 0,5 ml de una mezcla ácido-alco-
hol (75% de etanol, 1,5% de ácido clorhídrico 12 N y 23,5% de agua
destilada). Posteriormente, son sonicados y el extracto que se obtie-
ne se conserva a –20° C hasta su valoración mediante RIA.
4. Metabolismo de la glucosa
La determinación del metabolismo de la glucosa se llevó a cabo
en islotes fetales procedentes de cultivo primario siguiendo el méto-
do descrito por Malaisse y Sener (20).
Como marcadores radiactivos se usaron D-[5-3H]-glucosa y D-[6-
14C]-glucosa (Amersham-Pharmacia). La liberación de 3H2O a partir de
D-[5-3H]-glucosa nos proporciona la medida de la utilización global
de la molécula, mientras que su oxidación viene dada por la produc-
ción de 14CO2 a partir de D-[6-14C]-glucosa. Ambos productos fueron
determinados en un contador de centelleo líquido (1209 Rackbeta,
LKB WALLAC).
5. Análisis de proteínas mediante western-blot
Los extractos de proteínas se obtienen a partir de grupos de is-
lotes primarios que se recogen sobre hielo y se sonican durante un
minuto en tampón de lisis (Tris 12,5 mM; EGTA 1,25 mM; EDTA
1,25 mM; Triton X-100 0,25%; PMSF 2 mM; Leupeptina 10 µM;
Na3VO4 2 mM; Benzamidina 2 mM y Aprotinina 10 µg/ml). En oca-
siones, para aumentar la sensibilidad, se hace necesario llevar a
cabo una inmunoprecipitación de las muestras, cuya finalidad es
la separación de una proteína específica del extracto de proteínas
totales.
El análisis cuantitativo de las proteínas se llevó a cabo mediante
el método descrito por Bradford (21). Las proteínas se separan en un
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