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ELISA FERNÁNDEZ MILLÁN Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.
gel de poliacrilamida y posteriormente, son transferidas electroforé-
ticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Después
se incuba ésta con el anticuerpo primario correspondiente diluido en
TTBS (TBS con 0,05% de Tween-20) a 4º C durante toda la noche.
Tras esta incubación se lava con TTBS y se añade el anticuerpo
secundario con el que se incuba la membrana durante una hora con
agitación suave y a temperatura ambiente. Posteriormente se vuelve
a lavar. Para visualizar los inmunocomplejos se utiliza una técnica
de quimioluminiscencia (ECL Westerm blotting detection reagents,
Amersham Biosciences, UK).
6. Análisis del RNA total
6.1. Northern blot
El RNA total se extrae siguiendo el método descrito por
Chomczynski y Sacchi (22), basado en la utilización de una solución
monofásica de fenol y tiocianato de guanidina (Trizol, Gibco Life
Technologies).
Una vez cuantificado, la cantidad necesaria de RNA total es some-
tida a Northern blot siguiendo el método anteriormente descrito (23).
El cDNA correspondiente a la sonda de insulina, de tamaño 399 pares
de bases, fue cedido generosamente por S. J. Chan; Universisty of Chi-
cago, USA.
Las prehibridaciones e hibridaciones se realizan basándose en el
método de Amasino (24) y como control de carga se usa la sonda
ribosomal de 18S. Terminado el proceso, las membranas se introdu-
cen en una placa de autorradiografía para exponer, el tiempo ade-
cuado, una película de rayos X a –80º C (Kodak OMAT X-AR) que,
posteriormente, se revela utilizando un revelador Agfa, Curix 60.
6.2. Ensayo de protección de las ribonucleasas
Las muestras de RNA total se obtuvieron y valoraron siguiendo
el método descrito anteriormente (22). Se utilizaron 20 µg de RNA
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