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ELISA FERNÁNDEZ MILLÁN Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

8. Técnicas analíticas

8.1. Determinación de glucosa e insulina en plasma

Para la determinación de glucosa, el plasma obtenido es desprotei-
nizado con la mezcla de Somogyi [SO4Zn 0,08 M, Ba(OH)2 0,08 M] y,
a continuación, se centrifuga durante cinco minutos a 2.500 rpm. La
glucosa se analizó en el sobrenadante aplicando el método de la gluco-
sa-oxidasa acoplado a la oxidación de un cromógeno (BioSystems).

La insulinemia se valoró por radioinmunoanálisis (RIA) utilizan-
do un kit suministrado por la casa Linco (LINCO Research Inc.,
USA). Se parte de una sensibilidad de 0,1 ng/ml en la curva patrón
y se usaron 100 µl de suero de cada muestra.

8.2. Determinción de IGFs en suero

El IGF-1 en suero se mide por enzimoinmunoanálisis (EIA, Diag-
nostic Systems Laboratories, Texas, USA). La determinación sérica
de IGF-2 se lleva a cabo por el análisis de radiorreceptor (RRA).
Para el marcaje radiactivo de la hormona con 125I se utiliza una mo-
dificación del método de la cloramina T (26) y como hormona se
utiliza IGF-2 recombinante humano de R&D Systems (Abingdon,
UK). En ambos casos, el método incorpora un pretratamiento de las
muestras para evitar interferencias de las IGFBPs.

8.3. Determinación de la proliferación celular

Para valorar in vitro la proliferación de islotes fetales inducida
por glucosa y por el factor de crecimiento IGF-1 se usa un kit de
enzimoinmunoanálisis colorimétrico (Roche Diagnostics), basado en
la medida de la incorporación de BrdU durante la síntesis de DNA
de novo.

Se recogen grupos de 25 islotes fetales procedentes de cultivo
primario que se llevan a una placa de cultivo donde se adiciona el
medio correspondiente a cada condición [RPMI-1640 con glutami-
na suplementado con 3 mM ó 17 mM de glucosa, con o sin IGF-1

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