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VOL. 73 (2), 453-492, 2007 EFECTO DE LA SUBNUTRICIÓN MATERNA SOBRE EL...
de cada muestra que se dejaron precipitando en 0,1 volúmenes de
acetato sódico 3 M y 2,5 volúmenes de etanol puro a –20º C hasta el
momento de su análisis.
Los cDNAs correspondientes a las sondas de IGF-1 e IGF-2 de
rata han sido generosamente cedidas por los doctores C. T. Roberts
Jr. y D. LeRoith (National Institute of Health, Bethesda, MD). El
cDNA correspondiente a la sonda de 18S ribosomal se usa como
control de carga (pT7 RNA 18S antisense, Ambion, Austin, Texas).
Para el marcaje radiactivo de las sondas con (32a-P) dUTP (ICN,
Nuclear Iberica, Madrid, España) se sigue el protocolo indicado en
el kit Riboprobe Gemini II core system (Promega, Madison, WI,
USA). La hibridación del RNA total con la ribosonda marcada ha
sido descrito anteriormente (25) y los híbridos formados se someten
a electroforesis en gel de poliacrilamida empleando el sistema Sequi-
gen II Sequencing Cell de BioRad.
Una vez finalizada la electroforesis se mantiene el gel a –80º C en
contacto con una película sensible el tiempo necesario.
7. Estudios inmunohistoquímicos
El índice de replicación de células ß ha sido valorado in vitro en
cultivo primario de islotes fetales. La replicación de células ß se
mide añadiendo BrdU al medio de cultivo hasta una concentración
final de 100 µmol/l y después de una hora se recogen los islotes bajo
lupa, se incluyen en agarosa y una vez solidificada ésta, en parafina.
A continuación, los bloques de parafina se cortan con un microtomo
en finas secciones de 7 µm de espesor, cada una de las cuales es
fijada a continuación con calor sobre un portaobjetos. A un interva-
lo fijo de cada 72 secciones se procede al doble marcaje del tejido,
frente a la insulina y frente a la BrdU (kit de proliferación celular de
Amersham).
La valoración cuantitativa se lleva a cabo mediante un microsco-
pio Olympus BX40. El índice de proliferación de células ß viene ex-
presado por la relación porcentual de células ß que han incorporado
la BrdU en función del número total de células ß.
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