Page 91 - 73_01

VOL. 73 (1), 27-45, 2007 EL CAMBIO CONFORMACIONAL EN EL TCR DETECTA...

FIGURA 6. Únicamente la estimulación con un agonista fuerte induce
la exposición del epítopo de APA1/1 en timocitos. A. Esquema del dímero
H2-kb:Ig. B. La estimulación con H2-kb-OVAp induce la expresión del epítopo

de APA1/1. Se estimularon durante 30 minutos timocitos de un ratón OT-I
con los dímeros H2-kb (línea sombreada), H2-kb-E1 (E1, línea discontinua) y

H2-kb-OVAp (OVAp, línea continua). Se tiñó el dímero con un anticuerpo
anti-ratón FITC. Se permeabilizaron y tiñeron con APA1/1. Se analizaron por
citometría de flujo. Aparecen superpuestos los histogramas de las tres muestras
para la tinción de APA1/1. C. La estimulación con H2-kb:OVAp induce la unión
del TCR a GST-SH3.1 tanto en células de ganglio como en timocitos. Las células
de ganglio o timo de un ratón OT-I RAG2-/- fueron estimuladas con 0,5 µg/ml
de dímero H2-kb unido al péptido OVAp, E1 o sólo durante cinco minutos.
Se lisaron las células y se sometieron a un ensayo de pull-down con GST-SH3.1.
La presencia del TCR se detectó por western blot con el anticuerpo anti-CD3? 448.

E1 (16). Se detectó un incremento en el número de células APA1/1
positivas en los ratones inyectados con OVAp y E1 comparado con
el ratón inyectado con el péptido irrelevante (Figura 7). Sin embar-
go, en los ganglios las células T maduras sólo responden al péptido
OVAp. Para obtener datos más cuantitativos, se estimó el número de
células APA1/1 positivas en cada condición usando el progra-
ma ImageJ, se refirió al número total de células y se normalizó
frente a la fluorescencia del anticuerpo 25D1.16 para equilibrar los
niveles de expresión de ambos ligandos. El agonista fuerte OVAp fue

39