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RUTH M. RISUEÑO y BALBINO ALARCÓN AN. R. ACAD. NAC. FARM.

FIGURA 5. La estimulación con un anticuerpo anti-CD3 induce la exposición
del epítopo de APA1/1 en timocitos de ratón C57BL/6. A. La estimulación
con un anticuerpo anti-CD3 induce la unión del TCR a GST-Nck en células T
de ganglio y timocitos de ratón. Los lisados de las células de ganglio y de timo

de un ratón C57BL/6 estimuladas con el anticuerpo anti-CD3 145-2C11 (NE, no
estimulado; CD3, estimulado) fueron sometidas a un ensayo de pull-down con
GST-SH3.1. Se detectó el TCR precipitado por western blot con el anticuerpo

anti-CD3? 448. Como control negativo, se realizó un preaclarado con GST.
B. La estimulación con un anticuerpo anti-CD3 en timocitos DP induce

la exposición del epítopo reconocido por APA1/1. Se estimularon los timocitos
de un ratón C57BL/6 de igual forma que en A. Se tiñeron con los anticuerpos

anti-CD4, anti-CD8 y APA1/1 y se analizaron por citometría de flujo. El
histograma corresponde a la tinción de APA1/1 dentro de la población positiva

para CD4 y CD8 y superpuesta la muestras estimulada (línea continua), no
estimulada (línea discontinua) y el control isotípico (línea sombreada).

Para correlacionar estos datos de citometría de flujo utilizando el
anticuerpo APA1/1 con los ensayos de pull-down, las células T de
ganglio y timocitos fueron estimuladas con este conjunto de dímeros
de H2-kb:Ig cargados con OVAp, E1 o sin cargar. Posteriormente se
realizó un ensayo de pull-down con la proteína de fusión GST-Nck.
La unión del TCR a GST-Nck únicamente se inducía cuando el es-
tímulo utilizado eran los dímeros de H2-kb cargados con el agonista
fuerte OVAp tanto en timocitos como en células T maduras de gan-
glio de ratones OT-I (Figura 6C).

Para detectar la respuesta frente a agonistas fuertes (OVAp) y
débiles (E1) in vivo en células T maduras e inmaduras, se inyectaron
por vía endovenosa ratones OT-I con los péptidos OVAp y E1. Los
ratones fueron sacrificados a las 3 horas y se extrajeron los ganglios
linfáticos inguinales y el timo. Las secciones tisulares de cada ór-
gano fueron teñidas con el anticuerpo APA1/1 y con el anticuerpo
25D1.16 que reconoce el MHC H2-kb unido a los péptidos OVAp y

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