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RUTH M. RISUEÑO y BALBINO ALARCÓN AN. R. ACAD. NAC. FARM.

RESULTADOS

I. El epítopo de APA1/1 se expone tras la estimulación
I. con un anticuerpo anti-CD3 en timocitos

Previamente se había descrito que la estimulación con un anti-
cuerpo anti-CD3 induce la exposición del epítopo reconocido por
APA1/1 en células T de ganglio de ratón C57BL/6 (silvestre) (15).
Dicho epítopo es solapante con la región de poliprolinas de CD3e
responsable del reclutamiento de la proteína adaptadora Nck. La
exposición del epítopo de APA1/1 se produce por un cambio confor-
macional en la cadena CD3e. Para comprobar si dicho cambio con-
formacional, detectado por el anticuerpo APA1/1, también se produ-
cía en timocitos tras la estimulación, se extrajo el timo de un ratón
C57BL/6. Los timocitos fueron estimulados durante diez minutos
con un anticuerpo anti-CD3 y se detectó la fluorescencia del anti-
cuerpo APA1/1 por citometría de flujo. Al igual que en las células T
maduras (15), la estimulación con el anticuerpo anti-CD3 provocaba
un aumento de tinción con el anticuerpo APA1/1 (Figura 5B). Es
decir, los timocitos DP exponían la secuencia de poliprolinas de
CD3e (reconocida por APA1/1) al ser estimulados y, por lo tanto, se
producía un cambio conformacional en el TCR. Para comprobar
que dicho cambio conformacional también era detectado median-
te el ensayo de pull-down con GST-Nck (método mediante el cual
se describió el cambio conformacional que afecta a CD3e dependien-
te de ligando), se estimularon células T de ganglio y timocitos de los
mismos ratones silvestres con el mismo anticuerpo anti-CD3 y se
detectó el complejo TCR mediante western blot con un anticuer-
po anti-CD3? (CD3? es la última cadena en ensamblarse al TCR ma-
duro y, por lo tanto, sólo se detectan los TCR maduros unidos a
GST-Nck). En ambos casos y en concordancia con las tinciones con
APA1/1, la estimulación con el anticuerpo anti-CD3 inducía la unión
a GST-Nck del TCR, es decir, se inducía el cambio conformacional
(Figura 5A).

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