Page 87 - 73_01
P. 87
VOL. 73 (1), 27-45, 2007 EL CAMBIO CONFORMACIONAL EN EL TCR DETECTA...
3. Tinción de células por citometría
Se incubaron 2 x 105 células por tinción en presencia de 4 µg/ml
del anticuerpo primario directamente marcado pertinente durante
20 min a 0º C. Se fijaron y permeabilizaron con el reactivo Cytofix/
Cytoperm (BD Biosciences, San Diego, CA). Posteriormente se in-
cubaron con el anticuerpo APA1/1 biotinilado o con un anticuerpo
biotinilado isotípico control. Posteriormente se incubó en presencia
de una estreptavidina acoplada al flouróforo correspondiente. Las
células se lavaron y se resuspendieron en 300 µl de PBS 1x degasi-
ficado y se analizaron en un citómetro FCSCalibur usando el progra-
ma CellQuest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ).
4. Experimentos funcionales
4a. Estimulación de timocitos de ratones OT-I con los dímeros
4a. de H2kb
La estimulación de timocitos de ratones transgénicos OTI se rea-
lizó de acuerdo a lo ya publicado (15).
5. Ensayo de «pull-down»
Las fracciones postnucleares se sometieron al ensayo de pull-
down siguiendo el protocolo ya publicado (5).
6. Inmunohistoquímica
Se sacrificaron los ratones por dislocación cervical y se extrajo el
timo y los ganglios linfáticos inguinales. La fijación, corte y tinción
de los órganos, se realizó según las indicaciones ya publicadas (11).
35
