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VOL. 71 (2), 387-427, 2005 LA TOXINA BOTULÍNICA COMO MEDICAMENTO
La diálisis de los agregados contra puffer fosfato separa los com-
plejos M y la hemaglutinina, al menos en el caso de la neurotoxina
A. La hemaglutinina puede separarse absorbiéndola con hematíes
(Kozaki y cols. 1975).
La electroforésis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato
sódico separa las proteínas estabilizadoras de los agregados. Las
columnas de Sephadex (dietilaminoetil) retienen a todas las proteí-
nas de las soluciones de los cristales en un tampón de pH 7,2. La
elución de la columna con el mismo tampón con gradiente de CINa
separa dos fracciones: la a que contiene el 20% de las proteínas,
entre ellas la mayoría de la neurotoxina, siendo, (Knox y cols. 1970,
Lammanna y cols. 1970,Das Gupta y cols. 1966) tres a cinco veces
más tóxica que los cristales y escasa cantidad de una proteína de
similar peso, atóxica y no hemaglutinante. La ultracentrifugación
de la fracción a da un solo componente de 7,2S de 128.000 (±12.800)
de pm y la gel filtración otro componente único de 150.000 daltons.
Los cristales disueltos solución salina molar tamponada se resuelven
en complejos L (Sugii y cols. 1975). La ultra centrifugación de la
solución de los cristales en medio ácido solo da una banda pero en
un pH alto aparecen varias bandas. La disgregación de los agregados
en los que la toxina está protegida del pH ácido y de la pepsina,
libera a aquella. Por ello, por ejemplo, la toxicidad aumenta, si el
alimento se conserva a 0º C.
La neurotoxina se separa de los agregados y complejos, por el
método rojo que comienza precipitando el producto bajando el pH,
redisolviendo el precipitado en un buffer acuoso en el que al agregar
sulfato amónico precipita la neurotoxina muy pura y estable en for-
ma cristalina, que da una sola banda de precipitación con la anti-
toxina por el método de Ouchterlony. La toxina se liofiliza y el polvo
resultante se puede almacenar en viales pequeños. Hay también
cristales formados por la neurotoxina unida a la hemaglutinina, y en
algunos casos a otra proteína.
La neurotoxina se segrega como prototoxina que es un péptido
lineal de 1.291 aminoácidos de 150.000 a 167.000 daltones (unos
5,7 S) para la de los C. botulinum A y B. Un puente disulfuro in-
tracatenario, encorva a la cadena, dándole forma de “J”. La activa-
ción a neurotoxina se produce por la separación de los dos extremos
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