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6. PRUEBA DE CONCEPTO DE TERAPIA G%u00c9NICALENTIVIRAL PARA LA CORRECCI%u00d3N IN VITROE IN VIVO DE LA MUTACI%u00d3N EN EL GEN F5Y con todos estos resultados previos, llegabael momento de demostrar la prueba deconcepto de que un protocolo de terapiag%u00e9nica viral utilizando vectores lentivirales,pod%u00eda ser capaz de revertir un fenotipopatol%u00f3gico de una deficiencia de factor V.La elecci%u00f3n del vector viral es una de lascuestiones m%u00e1s dif%u00edciles y a la vez m%u00e1scruciales porque hay que intentar el equilibrioentre la eficacia y los efectos adversos. En laactualidad, son los vectores lentivirales yadenoasociados los que m%u00e1s se utilizan enaplicaciones cl%u00ednicas. Pero se ha de saber quelos vectores adenoasociados aunque seintegran m%u00ednimamente en el genoma, sonaltamente inmunog%u00e9nicos y desencadenan unarespuesta inmune muy fuerte que finaliza enhepatotoxicidad. Los vectores lentivirales porel contrario no son inmunog%u00e9nicos. Laelecci%u00f3n, a parte de tener en cuenta estascaracter%u00edsticas propias del vector, se debenecesarios del sistema CRISPR/Cas9. Tras losdistintos cruces necesarios, los individuoshomocigotos obtenidos y tras su genotipado,fueron sometidos a ensayos de coagulometr%u00eda,incluyendo niveles de FV, tiempo deprotrombina y tiempo de tromboplastinaparcial activada.Los estudios in silico ya suger%u00edan que lamutaci%u00f3n desestabilizaba la estructura del FV(activado sin el dominio B) tanto en lasvariantes de rat%u00f3n como humanas, lo que dabalugar a un fenotipo leve de la enfermedad.Se observ%u00f3 herencia mendeliana en ladescendencia y no se produjeron signosespont%u00e1neos por alteraci%u00f3n de la coagulaci%u00f3nsangu%u00ednea, ni muertes prematuras odisfunciones gestacionales. Los niveles de FVen los animales homocigotos fueron de 24,48%%u00b1 5,1 y 39,73 seg %u00b1 2,81; el TP un 61,81% %u00b16,31 y 23,41 seg %u00b1 1,64 (INR = 1,47 %u00b1 0,12); yel TTPa de 46,9 seg %u00b1 3,23. Estos datosdemostraban un modelo viable en rat%u00f3ndeficiente en FV por una mutaci%u00f3n sin sentidoinducida en el gen F5, con un fenotipo leve dela enfermedad, similar al observado enhumanos.36ANALESRANFwww.analesranf.comD%u00e9ficit de factor V y terapias avanzadasAntonio Liras et al.An. R.Acad. Farm.Vol. 91. n%u00ba1 (2025) %u00b7 pp. 17-44Figura 5. Obtenci%u00f3n de un modelo animal patol%u00f3gico en rat%u00f3n deficiente en factor V mediante edici%u00f3n g%u00e9nicay microinyecci%u00f3n directa en cigotos (F, generaci%u00f3n filial; FV, factor V; FVIII, factor VIII; HGMD, Human GeneMutation Database; INR, %u00cdndice Internacional Normalizado; TP, tiempo de protrombina; TTPa, tiempo detromboplastina parcial activada; WT, tipo salvaje)
