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vitro como los posteriores in vivo. Para elprimer abordaje de los estudios in vitroutilizando cultivos celulares, en el casoespec%u00edfico de la enfermedad que padecenuestra paciente, d%u00e9ficit severo de FV, debidoa sus caracter%u00edsticas cl%u00ednicas de riesgo desangrado, no pod%u00edamos contemplar laposibilidad de la obtenci%u00f3n de c%u00e9lulas porbiopsia hep%u00e1tica para su posterior cultivo. Poresta raz%u00f3n, una investigaci%u00f3n, en general,debe adaptarse a las peculiaridades concretasde la enfermedad, por lo que se decidi%u00f3preparar un modelo celular deficiente en FV.La %u201cherramienta%u201d m%u00e1s adecuada, comotambi%u00e9n se ha explicado m%u00e1s arriba, era laedici%u00f3n g%u00e9nica mediada por CRISPR/Cas9, porhomolog%u00eda en c%u00e9lulas HepG2 (Figura 4). Estal%u00ednea celular humana se caracteriza por estarinmortalizada, por su robustez, durabilidad,r%u00e1pida proliferaci%u00f3n y potencial para generarcolonias a partir de una sola c%u00e9lula. Adem%u00e1s,expresa FV de forma constitutiva, como lohace el h%u00edgado de forma fisiol%u00f3gica (57).As%u00ed (58), se gener%u00f3 un modelo celulardeficiente en FV mediante edici%u00f3n g%u00e9nicaCRISPR/Cas9 produciendo una mutaci%u00f3nsimilar a la que presentaba la pacienteestudiada (c.3279G>A, p.Trp1093*) (25). Estemodelo celular mutado presentaba,aproximadamente, un 19% de funcionalidad deFV con respecto a las c%u00e9lulas nativas.Se propuso adem%u00e1s y as%u00ed se demostr%u00f3, unanueva terapia avanzada basada en edici%u00f3ng%u00e9nica para la correcci%u00f3n de la mutaci%u00f3n.Pasos adicionales de deleci%u00f3n de precisi%u00f3n poruni%u00f3n hom%u00f3loga CRISPR/Cas9 permitieroncorregir el 41% de las c%u00e9lulas mutadas en elgen F5, produci%u00e9ndose una prote%u00edna funcional.El an%u00e1lisis de los genes fuera de diana (offtarget) no mostr%u00f3 ninguna modificaci%u00f3n en lassecuencias gen%u00e9ticas derivadas de edici%u00f3ninespec%u00edfica al menos en los genes estudiados.Este m%u00e9todo de correcci%u00f3n mediante edici%u00f3ng%u00e9nica se protegi%u00f3 mediante patente espa%u00f1ola(59) con cobertura internacional.Teniendo en cuenta las concentracionesSe dise%u00f1%u00f3 un protocolo espec%u00edfico pararatones, capaz de conseguir correcciones enlas muestras a diluciones de 1:100 para factorV y de 1:3 para el tiempo de protrombina. Elobjetivo era %u201csuavizar%u201d las curvas decalibraci%u00f3n, que presentan pendientes muypronunciadas y rangos de medici%u00f3n muyestrechos entre un punto de calibraci%u00f3n yotro. Se comprob%u00f3 que el periodo m%u00e1s establey %u00f3ptimo para la extracci%u00f3n de las muestras desangre era el comprendido en las primeras 6horas del periodo luminoso. No se observarondiferencias cl%u00ednicas entre sexos y seestablecieron los intervalos de referencia parafactor V (95,80% %u00b1 18,14; 25,21 seg %u00b1 1,34),para el tiempo de protrombina (104,31% %u00b114,52; 16,85 seg %u00b1 1,32) y para el tiempo detromboplastina parcial activada, diluci%u00f3n 1:1,(32,86 seg %u00b1 3,01). Tambi%u00e9n se utiliz%u00f3 el INR(%u00cdndice Internacional Normalizado) comoherramienta de estandarizaci%u00f3n para elmodelo de rat%u00f3n%u00b4(0,996 %u00b1 0,10).Adem%u00e1s, siguiendo la pr%u00e1ctica habitual de lacl%u00ednica en humanos, y contrariamente ainformes anteriores de la literatura, seestablecieron los porcentajes y los segundoscomo unidades de medida del nivel de FV enratones. La estrategia planteada en esteestudio puede ayudar a establecer intervalosde referencia y a detectar peque%u00f1asdiferencias entre individuos sanos y enfermosen el contexto de la biomedicina veterinariao humana, en la medicina transfusional o enlos modelos patol%u00f3gicos utilizados para lascoagulopat%u00edas cong%u00e9nitas, como puede ser eld%u00e9ficit de FV.4. OBTENCI%u00d3N DE UN MODELO CELULARDEFICIENTE EN FACTOR V MEDIANTE EDICI%u00d3NG%u00c9NICA, Y SU CORRECCI%u00d3NComo ya se ha comentado m%u00e1s arriba, para elestablecimiento de nuevos f%u00e1rmacos yestrategias como es el caso de las nuevasterapias avanzadas, se precisaineludiblemente la utilizaci%u00f3n de modelospatol%u00f3gicos tanto para estudios iniciales in34ANALESRANFwww.analesranf.comD%u00e9ficit de factor V y terapias avanzadasAntonio Liras et al.An. R.Acad. Farm.Vol. 91. n%u00ba1 (2025) %u00b7 pp. 17-44