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3.2. Perspectivas estructurales sobre losamiloides de RepA-WH1El primer hallazgo sobre las bases moleculares de laamiloidog%u00e9nesis del dominio RepA-wH1 (Figura 2b) fueque, una vez separado de wH2, su uni%u00f3n transitoria adistintas secuencias cortas (11 pares de bases) de DNAdel pl%u00e1smido promov%u00eda la formaci%u00f3n de diferentesensamblajes proteicos, incluyendo fibras (68). Esinteresante que la mutaci%u00f3n m%u00e1s frecuente encontradaen cribados gen%u00e9ticos dirigidos a modular la actividadde RepA en la replicaci%u00f3n del pl%u00e1smido, el cambio deAla31 por val en una regi%u00f3n propensa a laamiloidog%u00e9nesis en wH1 (L26vLCAVSLI34) (61), mejorabasustancialmente el ensamblaje de RepA-wH1 en fibrasamiloides in vitro. %u00c9stas ten%u00edan unas dimensiones de 25nm de grosor y una longitud variable, seg%u00fan revel%u00f3 lamicroscop%u00eda electr%u00f3nica de transmisi%u00f3n (TEM), estandoconstituidas por la asociaci%u00f3n lateral de variosfilamentos m%u00e1s finos (4 nm), en los cuales la prote%u00ednase ensamblaba como hebras helicoidales simples odobles con una secci%u00f3n axial tubular. Los filamentos setorsionaban en las fibras dando lugar a una superh%u00e9licelev%u00f3gira, de acuerdo con observaciones de microscop%u00edade fuerza at%u00f3mica (AFM) (69).Estudios recientes de resonancia magn%u00e9tica nuclear(NMR) revelaron que la uni%u00f3n del DNA a RepA-wH1desestabilizar%u00eda su interfaz de dimerizaci%u00f3n comol%u00e1mina-%u03b2, al romper la red de interacciones cati%u00f3n-%u03c0entre cadenas laterales de amino%u00e1cidos que contribuyea mantener unidas las dos subunidades de la prote%u00edna,aumentando as%u00ed la inestabilidad intr%u00ednsecade susextremos N y C-terminales (70). Estadesestabilizaci%u00f3n liberar%u00eda el lazo que incluye lasecuencia amiloidog%u00e9nica arriba mencionada parainiciar el autoensamblaje de RepA-wH1.Siendo el DNA un inductor de la amiloidog%u00e9nesis deRepA-wH1 (68), buscamos mediante un cribadocomputacional inhibidores de dicha interacci%u00f3n.Identificamos una variante tetrasulfonada de lamol%u00e9cula de %u00edndigo (S4-%u00edndigo) como ligando concapacidad para unirse a una superficie rica en residuosde arginina, centrados en torno al eje de simetr%u00edabinario del d%u00edmero RepA-wH1 y en posici%u00f3n distal alsegmento amiloidog%u00e9nico, que estar%u00eda implicada en elreconocimiento del DNA (71) (Figura 2b). Ensayos invitro demostraron que esta mol%u00e9cula, efectivamente,se un%u00eda a la prote%u00edna con afinidad submicromolar y eracapaz de bloquear el ensamblaje de las fibras RepAwH1 (71). Estudios de NMR revelaron que el S4-%u00edndigotambi%u00e9n previene la amiloidog%u00e9nesis a trav%u00e9s de unsegundo mecanismo: la uni%u00f3n a un bolsillo entre lainestable h%u00e9lice-%u03b1 N-terminal y una horquilla-%u03b2implicada en la dimerizaci%u00f3n, bloqueando as%u00ed ladisociaci%u00f3n promovida por el DNA de los d%u00edmeros RepAwH1 (70). El S4-%u00edndigo fue el primer inhibidor alost%u00e9ricodescrito de una amiloidog%u00e9nesis.3. RePA-WH1, EL PRIMER MODELO BACTERIANODE AMILOIDOSIS INTRACELULARUno de los protagonistas de la creaci%u00f3n de la biolog%u00edamolecular, Jacques Monod (1910-1976), en una apuestapor la universalidad de esa disciplina desarrolladafundamentalmente sobre modelos procari%u00f3ticos, afirm%u00f3que (en biolog%u00eda) %u201clo que es v%u00e1lido para E. coli es v%u00e1lidopara el elefante%u201d, aforismo que fue perdiendo fuerzaal ir desentra%u00f1%u00e1ndose la extraordinaria complejidad delos organismos eucariotas multicelulares. Cabeplantearse si ser%u00eda posible invertir los t%u00e9rminos de lasentencia de Monod, adaptando a las bacterias unproceso exclusivo de los organismos m%u00e1s complejos; as%u00ed%u00bfpodr%u00eda desarrollarse a partir de %u00e9stas un modelominimalista para el estudio de las proteinopat%u00edasamiloides? Con ese objetivo, en el laboratorio del autorse adopt%u00f3 a finales de la d%u00e9cada de 2000 unaaproximaci%u00f3n propia de la biolog%u00eda sint%u00e9tica para elestudio de los amiloides bacterianos, tanto en cuanto asu caracterizaci%u00f3n estructural y funcional como paraexplorar sus posibles aplicaciones en biotecnolog%u00eda ybiomedicina.3.1. RepA-WH1, un amiloide funcional en lareplicaci%u00f3n del DNA plasm%u00eddicoLas prote%u00ednas Rep son factores esenciales para lareplicaci%u00f3n de muchos pl%u00e1smidos en las bacterias Gramnegativas. En el laboratorio del autor se estudia, desdehace 30 a%u00f1os, la prote%u00edna RepA del pl%u00e1smido pPS10de Pseudomonas (Figura 2A). Como d%u00edmero, RepAreprime la transcripci%u00f3n de su propio promotormediante la uni%u00f3n a una secuencia operadora repetidainversamente, mientras que su monomerizaci%u00f3n alunirse a una secuencia de 22 pb repetida en t%u00e1ndem(iterones, en n%u00famero de cuatro, ubicados en el origende replicaci%u00f3n, oriV) activa a RepA para la iniciaci%u00f3n dela replicaci%u00f3n del DNA plasm%u00eddico (61). Una vez que secompleta la replicaci%u00f3n del DNA, RepA modula elensamblaje de un amiloide funcional que acoplaf%u00edsicamente las dos copias del pl%u00e1smido resultantes,inhibiendo as%u00ed rondas adicionales de replicaci%u00f3n (62).Clave en esa conmutaci%u00f3n funcional en RepA es uncambio conformacional que afecta al dominio Nterminal (wH1) en la prote%u00edna, incrementando sucontenido en l%u00e1mina-%u03b2, y que es desencadenado por suuni%u00f3n espec%u00edfica, pero con baja afinidad, a uno de losextremos de cada iter%u00f3n (63-65). El reconocimiento conmayor afinidad del otro extremo por el dominio Cterminal en RepA (wH2) (66), limita la uni%u00f3n de laprote%u00edna a la extensi%u00f3n precisa abarcada por lositerones (88 pb) (62). As%u00ed, la restricci%u00f3n topol%u00f3gica desu agregaci%u00f3n por la secuencia diana en el DNA es elmecanismo a trav%u00e9s del cual RepA ensambla un amiloidefuncional, evitando su polimerizaci%u00f3n indefinida quepodr%u00eda llevar a una agregaci%u00f3n amiloide citot%u00f3xica (67).90ANALESRANFwww.analesranf.comMicrobiota as a %u2018black swan%u2019: The strange case of bacterialamyloids and neurodegenerationRafael Giraldo Su%u00e1rezAn. R. Acad. Farm.Vol. 90. n%u00ba 1 (2024) %u00b7 pp. 83-96