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ANALESRANFwww.analesranf.comEl segmento amiloidog%u00e9nico hidrof%u00f3bico en RepAwH1 es, por s%u00ed mismo, una pieza adecuada para eldesarrollo de dispositivos sint%u00e9ticos cuando se incluyeen otros amiloides funcionales conocidos (Figura 2C).Al sustituir las repeticiones polares oligopept%u00eddicas ricasen glutamina y asparagina de la prote%u00edna de levaduraSup35 por varias copias en t%u00e1ndem del p%u00e9ptidoamiloidog%u00e9nico R25LvLCAvSLID35G de RepA-wH1, seconstruy%u00f3 una serie de nuevos priones h%u00edbridos, [REPPSI+] (76), que imitaban el fenotipo del prion natural delevadura [PSI+] al causar la lectura corrida de codonesde terminaci%u00f3n de la traducci%u00f3n (77). Este dise%u00f1o seaplic%u00f3 despu%u00e9s para fusionar las mismas repeticiones deRepA-wH1 a RF1, uno de los dos factores determinaci%u00f3n de la traducci%u00f3n de E. coli, de tal maneraque la agregaci%u00f3n amiloide de la quimera daba lugar aque los ribosomas tradujeran, sin detenerse, el mRNAa trav%u00e9s de un cod%u00f3n de parada prematuro insertado enel gen reportero lacZ. Se implement%u00f3 as%u00ed en bacteriasun concepto de ingenier%u00eda inspirado en un prion delevadura, lo que permiti%u00f3 adem%u00e1s el ensayo in vivo demol%u00e9culas naturales anti-amiloidog%u00e9nicas, como laEGCG y el resveratrol (78).3.4. RepA-WH1 genera una proteinopat%u00eda pri%u00f3nicasint%u00e9tica en bacteriasLa presi%u00f3n evolutiva para el plegamiento eficiente delas prote%u00ednas parece haber seleccionado negativamentede forma natural cualquier amiloidosis proteot%u00f3xicaintracelular en bacterias (40). Por lo tanto, paraabordar la generaci%u00f3n de una amiloidosis bacterianasint%u00e9tica, expresamos RepA-wH1 en E. coli con unaprote%u00edna fluorescente fusionada a su extremo Cterminal, para poder visualizarla y sustituir al dominiowH2, liberando as%u00ed a wH1 de su papel como amiloidefuncional (79) (Figura 2D). Este enfoque permiti%u00f3rastrear la generaci%u00f3n de agregados citos%u00f3licos queinhib%u00edan la proliferaci%u00f3n bacteriana, comprobar lacapacidad de estos agregados, una vez purificados, denuclear el crecimiento de fibras amiloides de RepA-wH1in vitro, y explorar la dominancia en la coagregaci%u00f3nde distintas variantes mutantes de la prote%u00edna (79,80).La segregaci%u00f3n (vertical) entre c%u00e9lula madre y c%u00e9lulashijas de agregados proteicos suele ser asim%u00e9trica en E.coli para garantizar que una de las dos c%u00e9lulasresultantes no herede prote%u00ednas da%u00f1adas (81). Sinembargo, al estudiar la proliferaci%u00f3n de E. coli dentrode los canales de un dispositivo microflu%u00eddico, losagregados de RepA-wH1 se segregaron por igual entrelas c%u00e9lulas hijas, reduciendo as%u00ed la probabilidad deconseguir bacterias %u201ccuradas%u201d de part%u00edculas amiloidesy permitiendo la propagaci%u00f3n epigen%u00e9tica estable de%u00e9stas en los linajes celulares (82). Esas c%u00e9lulasbacterianas, siendo isog%u00e9nicas, mostraron dos fenotiposdistintos en relaci%u00f3n con los agregados: o bien m%u00faltiples3.3. Interruptores sint%u00e9ticos de laamiloidog%u00e9nesis de RepA-WH1Hemos explorado formas alternativas de controlar laamiloidog%u00e9nesis de RepA-wH1, adem%u00e1s de la uni%u00f3n alDNA (Figura 2b). Entre ellas, destaca que ves%u00edculaslip%u00eddicas que incluyen fosfol%u00edpidos %u00e1cidos (cardiolipina,fosfatidil-glicerol) promov%u00edan tanto la agregaci%u00f3n deRepA-wH1 como su inserci%u00f3n en membranas modelo,formando poros oligom%u00e9ricos anulares con un di%u00e1metrosimilar al descrito para los t%u00fabulos fibrilares amiloides(72). La disposici%u00f3n espacial en las membranas de lascabezas de fosfol%u00edpidos cargadas negativamente podr%u00edaproporcionar un patr%u00f3n bidimensional reconocido porRepA-wH1, de forma mim%u00e9tica al de los fosfatos en elDNA efector. Explorando otros efectos de superficies enla amiloidog%u00e9nesis, RepA-wH1 se funcionaliz%u00f3 sobrenanopart%u00edculas de oro, formando olig%u00f3meros resistentesa la desnaturalizaci%u00f3n que nuclearon eficientemente elcrecimiento de fibras amiloides, lo que gener%u00f3 unafirma espectral en ensayos de dispersi%u00f3n Ramanmejorada en superficie (SERS) que puede utilizarse paramonitorizar la polimerizaci%u00f3n amiloide (73) (Figura 2b).Otra herramienta generada para conseguir controlarla amiloidog%u00e9nesis de RepA-wH1 fue un anticuerpomonoclonal (b3h7) que reconoc%u00eda los olig%u00f3meros de laprote%u00edna en la v%u00eda que conduce a las fibras amiloides,inhibiendo as%u00ed el ensamblaje de %u00e9stas (74) (Figura 2b).b3h7 fue decisivo para identificar el nucleoidebacteriano como el lugar del ensamblaje inicial de losamiloides RepA-wH1 (74), y el puente transplasm%u00eddicoentre mol%u00e9culas de RepA unidas a los iterones como unolig%u00f3mero amiloide (v%u00e9ase m%u00e1s arriba) (67) (Figura 2A).La fusi%u00f3n optogen%u00e9tica de un dominio fotorreceptorvegetal (LOv2, que responde a la luz azul) con RepAwH1 ha permitido recientemente canalizar elplegamiento de esta %u00faltima prote%u00edna hacia laamiloidog%u00e9nesis (75). En una quimera LOv2-wH1, laabsorci%u00f3n de fotones de luz azul por el cofactormononucle%u00f3tido de flavina (FMN) sito en el dominioLOv2 despliega la h%u00e9lice-%uf061 C-terminal en %u00e9ste (J%uf061) y,por tanto, tambi%u00e9n la h%u00e9lice-%uf061 N-terminal de wH1 (%uf0611)que estaba fusionada a ella, lo que desestabiliza eldominio wH1 completo (Figura 2b). Cuando se utiliz%u00f3para nuclear la amiloidog%u00e9nesis in vitro, al seriluminada con luz azul la quimera LOv2-wH1 molde%u00f3 elensamblaje de olig%u00f3meros RepA-wH1, mientras que enla oscuridad dio lugar a haces de fibras y l%u00e1minas deRepA-wH1. A nivel macrosc%u00f3pico, la oscuridad produjouna transici%u00f3n de fase irreversible de l%u00edquido a hidrogelen LOv2-wH1. La expresi%u00f3n bajo iluminaci%u00f3n con luzazul de LOv2-wH1 en E. coli condujo a la generaci%u00f3nde agregados oligom%u00e9ricos citot%u00f3xicos que redujeron laviabilidad de las bacterias, allanando el camino a unanueva clase de potenciales agentes antimicrobianos(que denominamos %u201coptobi%u00f3ticos%u201d) (75).De la microbiota como %u201ccisne negro%u201d: El extra%u00f1o caso de losamiloides bacterianos y la neurodegeneraci%u00f3nRafael Giraldo Su%u00e1rez91 An. R.Acad. Farm.Vol. 90. n%u00ba 1 (2024) %u00b7 pp. 83-96