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225ANALESRANFwwwanalesranfcomEfectosprotectoresdelasproantocianidinas anivelintestinal frente aestrés termooxidativoporingestiónde aceitede girasolutilizadoen frituraRocíoRedondo-Castillejoet alAnRealAcadFarmVol87nº3(2021)·pp221-237macenóen formol(4%)para su fijación yposteriormontajeenparafinaparaladetecciónylocalizacióndelasproteínasestudiadasin situenel tejido Seestudiólainmunorreactividaddelas siguientesproteínaseltransportadorNPC1L1ACAT-2yMTP.25Técnicasdelaboratorio25aCuantificacióndelagrasaLadeterminación ycuantificacióndegrasaenelestómagoeintestinosellevóacabodeacuerdoalametodologíapropuestaporBlighyDyerconcloroformo/metanol(28)25bDeterminacióndelaalteracióntermooxidativaenelaceiteutilizadoenfriturayenellumengástricoeintestinalLacuantificacióndelaalteración totalen formadeCPenel AG yenlagrasaobtenidaporperfusióndellumengástricoeintestinalserealizósiguiendolatécnicacromatográficaencolumnadegeldesílicedeDobarganesetal.(29)Seeluyó1gdeaceiteprimeroconhexanoéterdietílico9010parasepararlos TGnoalteradosocomponenteapolary,posteriormenteconéterdietílicoparalaelucióndeloscompuestosdealteraciónhidrolítica y termooxidativademayorpolaridadquelos TGnoalteradosLasdos fraccionesseevaporaronenrotavaporysecuantificaronmediantegravimetríaPosteriormenteseprocedióalaidentificacióndeloscompuestosqueintegrabanlafraccióndecompuestoshidrolíticos(DGMG y AGL) yla fraccióndecompuestos termooxidados(PTG yDTGoxidadosonooxidados y TGox)porcromatografíadealtaeficaciaporseparacióndemasamolecular(HPSECdelassiglaseninglésdeHigh-performancesize-exclusionchromatography)mediantelautilizacióndedoscolumnasdepoliestireno-divinilbenceno(PL-gel)acopladasenserieyconectadasaunrefractómetro(AgilentBarcelona)Laidentificacióndeloscompuestosseefectuóatendiendoasustiemposderetenciónpreviamentecomprobadosporelusodepatronesde AGLMGDG y TG ydeaceitesalteradosconocidosparalosDTGyPTGLacuantificacióndeloscompuestosserealizómedianterefractometríaaceptandounarespuesta similarparatodosloscompuestoshidrolíticosytermooxidados25cSeparacióndequilomicronesCuantificacióndecolesterolytriglicéridosLosquilomicronesplasmáticos se separaronporgradientessalinosdedensidadapartirde2mLdeplasmamedianteultracentrifugacióna30000rpm(153000g)a4ºCenunaultracentrífugaBeckmanL8-70MrotorSW-401(PaloAltoCAEEUU)siguiendoloseñaladoporBocanegraetal.(30)LaconcentracióndecolesterolplasmáticosedeterminóutilizandoelkitenzimáticocolorimétricodeCHOD-POD(SpinreactBarcelona)mientrasquelade TGenplasma yenquilomicronessecuantificóconeldeGPOPOD(SpinreactBarcelona)Laduracióndecadafriturafuede5minutospudiendocalcularseeltotaldeminutosdecalentamientodelaceiteen140minutosLafibrainsolublericaentaninoscondensadosoproantocianidinas-seobtuvodelosfrutosdealgarrobo(Ceratoniasiliqua,L)segúnelprocedimientodescritoenlapatenteWO/2004/014150(27)Traslaretiradadelassemillaslapulpaselavó3 vecesdurante45minutosconaguaa45°C yagitaciónconstantedescartandoellíquidodelavadoLapulpahúmedaresultantesehomogeneizóconaguaenunaproporciónde12(p/p) y seagitóvigorosamentedurante 3horasa80 ºC Seguidamente y tras filtrarlapulpaellíquidoobtenidosedejóenfriarysesometióaunprocesodedecantacióna temperaturaambientedurante seishorasFinalmentelamuestradecantada secentrifugóa 2500g y seeliminóelsobrenadanteElresiduoresultantesesecóa85°Cy02atmósferasdepresióndurante12horasenunaestufaUna vezenfriadoelresiduosemolturó yse tamizóhastaobtenerun tamañodepartículainferiora180 µm23DiseñoexperimentalDurantesietedíassinmanteneralosanimalesensituacióndeayunonocturnoseinoculóporsondaesofágicaelAGalterado(grupoAG)olamezclaextemporáneadelAGalteradoconCFE(grupoAG-CFE)esteúltimoañadidoenlacantidadde125mg/kgdepesodelanimalSeemplearon 2gdelaceiteolamezclalosdías1y7y1glosdías2-6delestudioElséptimodíadetratamientoelAGalteradoolamezclaAG-CFEfueronadministradosenestadodeayuno Alas treshorasdelaadministraciónlosanimales fueronanestesiados y sacrificadosmedianteextraccióndesangredelaaortadescendenteconunajeringaheparinizadaAcontinuaciónseaislaronelestómagoyelintestinodelgado(separandoduodenoyeyunoeíleon)24PreparacióndelasmuestrasLasangreobtenidaenelsacrificiosecentrifugóa2500rpm(1500g)durante20minobteniendoasíelplasmaparadeterminarlosTGyelcolesterolasícomolosTGenquilomicronesElcontenidoluminaldelestómago ydelintestinodelgadoserecogióporarrastreperfundiendolentamentecon10mLdesoluciónsalinaelestómagoycon50mLelintestinoPosteriormentesecuantificóyanalizólacantidadtotalyloscomponentesdealteracióndelagrasaremanenteenestasregionesCadaporcióndelintestinodelgadosedividióendospartesequivalentesUnasehomogeneizóyseprepararonextractosparadeterminarlaactividadylosnivelesdeproteína(abundancia)delasenzimassuperóxidodismutasa(SOD)catalasa(CAT)glutatiónreductasa(GR)glutatiónperoxidasa(GPx)yhemo-oxigenasa-1(HO1)Laotraparteseal-