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minutos en hielo para obtener los lisados celulares totales. Después
de la determinación del contenido de proteína con el reactivo de
Bradford, se inmunoprecipitó una cantidad igual de proteína (500
µg) con anticuerpo anti-IRS1 (sc-8038, Santa Cruz Biotechnology
Inc., Heidelberg, Alemania). Los complejos inmunes se recogieron
en perlas de sefarosa (GE17-0120-01, Merck KGaA, Darmstadt, Ale-
mania), se calentaron a 95ºC durante 5 minutos en tampón de carga
Laemmli (Tris 100 mM pH 7,6, glicerol al 10% (v/v), SDS al 6%
(p/v), azul de bromofenol al 0,2% (p/v), ß mercaeptoetanol 2 mM)
y se sometieron al análisis de proteínas por Western blot.
2.7. Preparación de extractos de proteínas totales
Al final del experimento, después de lavar con PBS, las
células se lisaron en la placa con 100 µL de tampón de carga
Laemmli, se calentaron a 95ºC durante 5 minutos y se sometieron
al análisis de proteínas por Western blot.
2.8. Análisis de proteínas por Western blot
Las proteínas se separaron en un gel de poliacrilamida-
SDS y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad Inc.,
Hercules, CA, EE.UU.) que se incubaron en solución de bloqueo
(leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris -
TBS- o BSA al 3% en TBS) durante 1 hora a temperatura ambiente.
A continuación, las membranas se incubaron durante la noche a 4ºC
con los correspondientes anticuerpos primarios diluidos en TBS-T
(0,1% Tween-20 en TBS) con leche desnatada o BSA al 1%: anti-
VHC core (clon C7-50) de Affinity BioReagents; anti-HCV NS5A de
Virostat; anti-IRS1 (06-248) de Merk-Millipore (Darmstadt, Alema-
nia); anti-p53 (sc-126), anti-pTyr1146 IR (sc-81499), anti-IR (sc-
711), anti-fosfoserina (4A3, sc-81516), anti-pSer473 AKT
(sc-7985-R) y anti-AKT (sc-5298) de Santa Cruz Biotechnology; anti-
pSer256 FoxO1 (9461) y anti-pSer9 GSK3ß (9336) de Cell Signaling
Technology (Boston, MA, EE.UU.); anti-ßactina (A-5441) de Sigma-
Aldrich Inc. (Madrid, España).
Posteriormente, las membranas se lavaron tres veces en
TBS-T y se incubaron con IgG de cabra anti-ratón o anti-conejo mar-
cada con peroxidasa (Pierce, Rockford, IL) diluida en TBS-T durante
45 minutos a temperatura ambiente. Después de tres lavados en
TBS-T, se visualizó el anticuerpo unido a la membrana con el sus-
trato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce). El análisis
densitométrico de las bandas de proteína se realizó utilizando el
software ImageJ Biological Image Analysis (NIH, Bethesda, MD, EE.
UU.). Los resultados de la cuantificación de los blots de todos los ex- se añadió una solución de ácido peryódico al 0.5% (Sigma-Aldrich
perimentos se expresaron en porcentaje de estimulación con insulina
en relación con la condición de DMSO (100%), o en veces de cambio
en relación a la condición DMSO (1).
Sofosbuvir Treatment Improves Hepatitis C Virus-Induced In-
18 sulin Resistance
Esther Rey, Patricia Marañón y Águeda González-Rodríguez
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº1 (2021) · pp. 15 - 26
ANALES
RANF
www.analesranf.com
2.9. Análisis de expresión génica mediante PCR cuanti-
tativa en tiempo real (RT-qPCR)
El ARN total se extrajo con Reactivo TRI (Vitro, Sevilla, Es-
paña). Seguidamente, el ADNc se obtuvo a partir de 1 µg de ARN
mediante transcripción inversa (kit del sistema de transcripción in-
versa, Promega Inc., Madison, WI, EE. UU.). La RT-qPCR se llevó a
cabo en un sistema detector de secuencias de PCR en tiempo real Ste-
pOnePlus ™(Thermo Fisher Scientific Inc., Madrid, España) utili-
zando un kit SYBR Green (Promega Inc.) y cebadores aleatorios
d(N)6 que se compraron a Metabion (Planegg, Alemania):
5’-TACGTCCTCTTCCCCATCTG-3’ y 5’-TCCCTGGTCCAGTCTCACAA-3’
para glucosa 6 fosfatasa, 5’-CCAGGCAGTGAGGGAGTTTCT-3’ y 5’-
ACTGTGTCTCTTTGCTCTTGG-3’ para fosfoenolpiruvato carboxiqui-
nasa, 5’-CACCTGCTGGAAACCACACTT-3’ y
5’-AAGGTGAACCGGGACAGAGA-3’ para PTP1B, 5’-AAGACATTATGA-
CACCGCCAAA-3’ y 5’-GTTCTAGCTGTGGTGGGTTATGG-3’ para PTEN,
5’-GAGCACTTGATCGCCTACAAGA-3’ y 5’-ACCACGGTCATCTG-
GATCTGA-3’ para PP2A. El gen 36B4 se utilizó como gen constitutivo
normalizador. Los resultados se expresaron en veces de cambio en
relación a la condición DMSO (1).
2.10. Análisis del contenido celular de glucógeno
Después retirar el suero del medio durante la noche, las
células se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron con 200 µL
de H2Od y se incubaron en hielo durante 10 minutos. A continuación,
las muestras se hirvieron a 100ºC durante 10 minutos para inactivar
las enzimas y se centrifugaron a 13000 rpm durante 10 minutos más.
El contenido de glucógeno en los sobrenadantes se midió con el kit
de glucógeno Glycogen Assay Kit II (ab169558, Abcam, Cambridge,
Reino Unido). Los resultados se expresaron en µg de glucógeno nor-
malizados por la proteína total (mg de proteína).
2.11. Tinción de PAS (Periodic acid-Schiff)
Las células se cultivaron sobre un cubreobjetos de vidrio
de 12 mm de diámetro. Tras retirar el suero del medio durante la
noche, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con pa-
raformaldehído al 4% durante 10 minutos. Para la tinción de PAS
Inc. Madrid, España) durante 5 minutos y, a continuación, se tiñeron
con el reactivo de Schiff (Sigma-Aldrich Inc. Madrid, España) durante
15 minutos. Por último, se realizó la contratinción con hematoxilina
durante 2 minutos y se montaron con el medio de montaje Permount
(Thermo Fisher Scientific Inc.). Las preparaciones se examinaron con
un microscopio óptico Nikon Eclipse E400 (Nikon, Japón). El análisis
de las imágenes se realizó utilizando el software ImageJ Biological
Image Analysis (NIH). Los resultados de la cuantificación de las imá-
genes de todos los experimentos se expresaron en unidades arbitra-
rias (u.a.).