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ANALES fección, el medio de cultivo suplementado con gentamicina B1 se
RANF reemplazó 2 veces por semana, y, finalmente, se aislaron las colo-
nias resistentes que son las que expresan un replicón completo de
www.analesranf.com VHC.

SOF/Ledipasvir (LED)/RBV (n=12); SOF/DAC (n=5); SOF/LED 2.3. Tratamiento de las células con el fármaco antiviral
(n=16) o SOF/Simeprevir (SIM) (n=2). La duración del trata- El sofosbuvir (SOF, proporcionado amablemente por Gi-
miento osciló entre 12 semanas (n=35) y 24 semanas (n=7).
lead Science Inc., EE. UU.) se reconstituyó en DMSO a una concen-
La presencia de fibrosis hepática se evaluó mediante elas- tración de 10 mM. Las células portadoras del replicón del VHC se
tografía transitoria no invasiva (Fibroscan® 402, Echosens, París, trataron con sofosbuvir a 10 µM durante 9 días en ausencia de G418
Francia) y los pacientes se estratificaron siguiendo la siguiente es- para evitar la muerte de las células una vez eliminado el replicón.
cala: F0-F1, < 7 kPa, ausencia de fibrosis o fibrosis leve; F2, 7-9,4 Cada 3 días el medio de cultivo se sustituyó por medio fresco que
kPa, fibrosis moderada; F3, 9,5-13 kPa, fibrosis avanzada; F4, > contenía sofosbuvir o vehículo (DMSO).
13 kPa, cirrosis.
2.4. Análisis de la activación de la cascada de señaliza-
Los parámetros demográficos, antropométricos, virológi- ción de insulina
cos y bioquímicos se registraron de la siguiente manera: edad, sexo,
índice de masa corporal (IMC), cuantificación de ARN del VHC, ge- Para evaluar los efectos de sofosbuvir sobre la señalización
notipo del VHC, historia previa del tratamiento antiviral, y pruebas de la insulina, se retiró el suero del medio a las células portadoras
generales de laboratorio (aspartato aminotransferasa -AST-, ala- del replicón del VHC tratadas con sofosbuvir o DMSO antes de la es-
nina aminotransferasa -ALT-, gammaglutamiltransferasa -GGT-, timulación con insulina (1 o 10 nM, 10 minutos).
fosfatasa alcalina -ALP-, albúmina, bilirrubina, creatinina, glucosa,
insulina, hemoglobina glicosilada -HBa1c-, colesterol total, coles- 2.5. Análisis de proteínas por inmunofluorescencia
terol unido a lipoproteínas de baja densidad -LDL-, colesterol unido Las células se cultivaron sobre un cubreobjetos de vidrio
a lipoproteínas de alta densidad -HDL-, apolipoproteína B -ApoB-
y triglicéridos -TG-). El índice de resistencia a la insulina HOMA se de 12 mm de diámetro. Al final del experimento, las células se fija-
calculó aplicando la siguiente fórmula: insulina en ayunas (µU/mL) ron con paraformaldehído al 4% en solución salina tamponada con
× glucosa en ayunas (mg/dL) / 405. El índice de fibrosis FIB4, mé- fosfato (PBS) durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se per-
todo no invasivo que predice la presencia de fibrosis hepática, se meabilizaron con NP-40 al 0,1% en PBS durante 10 minutos a tem-
calculó aplicando la siguiente fórmula: edad (años) × AST (U/L) peratura ambiente. A continuación, las células se bloquearon con
/ [plaquetas (109/L) × ALT/2 (U/L)]. TNB (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M, reactivo de bloqueo al 0,5% -
Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania-) durante 30
Para el análisis de estas variables virológicas, bioquímicas minutos a 37ºC y se incubaron con los correspondientes anticuerpos
y metabólicas se recogieron muestras de sangre al inicio del estudio primarios diluidos en TNB durante 1 hora a 37ºC: anti-VHC core
(basal, B), al final del tratamiento (FdT) y un año después del final (clon C7-50, Affinity BioReagents, Goleen, CO) o anti-VHC NS5A (Vi-
del tratamiento (final del seguimiento, FdS). rostat, Portland, ME). Después de lavar con NP-40 al 0,1% en PBS,
las células se incubaron con el anticuerpo secundario IgG de cabra
2.2. Cultivo celular anti-ratón Alexa 488 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) durante
Para el estudio experimental, se utilizó la línea celular de 20 minutos a 37ºC, se contratiñeron con DAPI (Pierce, Rockford, IL)
y se montaron en el medio de montaje DakoCytomation (DAKO A /
hepatoma humano Huh7. Las células Huh7 y sus derivados se cul- S, Glostrup, Dinamarca). Las preparaciones se examinaron con un
tivaron en medio DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco) microscopio confocal Leica TCS-SP5 (Leica Microsystems, Heidelberg,
enriquecido (suero fetal bovino 10%, L-glutamina 2 mM y antibió- Alemania).
ticos: gentamicina 50 µg/mL, penicilina 100 U/mL y 100 estrepto-
micina µg/mL), a 37ºC en una atmósfera de CO2 al 5%. Las células 2.6. Preparación de extractos de proteínas para inmu-
Huh7 que expresan un replicón completo de VHC de genotipo 1b noprecipitación
(Con1; número de acceso a la base de datos EMBL AJ238799) se es-
tablecieron como se ha descrito previamente (22). Brevemente, las Al final del experimento, las células se lisaron con tampón
construcciones pI389/Core-3’/5.1 y pI377/NS3-3’ se linealizaron con RIPA (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, Triton X-100 al 1%, SDS al 0,2%,
ScaI y se usaron como secuencia molde para la síntesis de ARN uti- EDTA 1 mM, PMSF 1 mM y 5 µg/mL de leupeptina) durante 10
lizando la polimerasa ARN T7 (Promega, Madison, WI). Para la
transfección mediante electroporación de 107 células Huh7 se utili-
zaron 20 µg del ARN sintetizado, y 24 horas más tarde se realizó
la selección antibiótica de las células transfectadas añadiendo gen-
tamicina B1 (500 µg/ml, G418). Durante 4 semanas tras la trans-

El tratamiento con sofosbuvir mejora la resistencia a la 17
insulina inducida por el virus de la hepatitis C

Esther Rey, Patricia Marañón y Águeda González-Rodríguez
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº1 (2021) · pp. 15 - 26