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New pharmaceutical formulations from nanotechnology for cancer treatment based on gene therapy strategies

ciclos de congelación-descongelación a -80ºC, se distribución y la capacidad de transfección de los
recogieron en tubos eppendorfs y se centrifugaron a 12000 complejos in vivo se extrajeron los órganos corazón,
rpm durante 5 minutos. Mediante el análisis en el hígado, pulmón y bazo, y se procedió de la misma manera
luminómetro Sirius, Berthold detection system indicada para la determinación de la expresión de
(Alemania), se determinaron los ng de luciferasa por mL luciferasa in vitro.
en base a una recta patrón previamente calculada. Se
normalizaron los resultados calculando los mg de proteína 3. RESULTADOS
mediante el kit Bio-Rad DC™ Protein Assay.
3.1. Formulaciones poliméricas.

2.2.d. Evaluación de la toxicidad de los poliplejos y 3.1.a. Caracterización físico-química
lipoplejos
El tamaño de partícula se analizó mediante
La viabilidad celular fue cuantificada mediante el difractometría de rayos láser. Se prepararon formulaciones
ensayo “Alamar Blue”. 1 ml al 10% de “Alamar blue” con polietilenimina 25 kDa (PEI 25) y el plásmido que
resuspendido en DME-HG suplementado con un 10% codifica para la luciferasa a relación N/P 4. Se realizó un
(v/v) de suero fue añadido por pocillo 48 horas post- seguimiento de las partículas a lo largo del tiempo para
transfección. Después de 2,5 horas de incubación a 37ºC, asegurar que el tamaño y el potencial zeta eran constantes
200 µl del sobrenadante fueron analizados mediante la hasta el momento de su utilización. Se comprobó que,
medida de la absorbancia a 570 y 600 nm. La viabilidad tanto el diámetro como el potencial zeta eran idóneos para
celular fue calculada según la fórmula (A570-A600) de las realizar los ensayos in vitro e in vivo preparándose 5
células tratadas x 100/(A570-A600) de las células control. formulaciones distintas:

2.2.e. Estudios in vivo Formulación 1

Todos los animales utilizados en este estudio fueron PEI 25

aprobados y controlados por el Comité Ético para la Formulación 2

Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de PEI 25 + transferrina (32 µg/µg ADN)

Navarra (protocolo ético, 075-11), y tratados de acuerdo a Formulación 3

las guías de protección animal. Se utilizaron ratones PEI 25 + transferrina (32 µg/µg ADN) + protamina
hembra Balb-C de Harlan Ibérica Laboratories, (0,5 µg/µg ADN)
(Barcelona, España). Se inyectó por ratón un volumen de
200 µl de complejo que contenía 60 µg de ADN. Todas las Formulación 4
administraciones fueron llevadas a cabo mediante PEI 25 + asialofetuína (0,5 µg/µg ADN)
inyección en la vena de la cola.
Formulación 5

En la preparación de los lipoplejos para su utilización PEI 25 + asialofetuína (0,5 µg/µg ADN) + protamina
in vivo, se tuvo en cuenta la caracterización físico- (0,4 µg/µg ADN)

química, ya que es importante el control de posibles Todas las formulaciones están realizadas a una

agregados en las formulaciones, que puede provocar la concentración de ADN de 10 µg/ml.

muerte del animal. Para ello, preparamos las El tamaño obtenido fue óptimo para realizar las

formulaciones y las centrifugamos en Amicones® 30K, de transfecciones al igual que el potencial zeta. La adición de

Merck Millipore Ltd. (Alemania). El tamaño de partícula y los ligandos transferrina y asialofetuína no modificaron

el potencial zeta se determinaron por difractometría de significativamente el tamaño de partícula. Sin embargo, sí

láser utilizando un analizador de partículas denominado podemos ver que al añadir transferrina, el potencial zeta

Zetasizer Nano Series (Malvern Instruments Inc., Reino disminuye, y que en el caso de la asialofetuína este valor

Unido). Las medidas se realizaron por triplicado. Para la no varía. El potencial zeta siempre fue positivo, el tamaño
cuantificación ex vivo de la actividad de la luciferasa, los nanométrico y la polidispersión fue buena, manteniéndose
animales fueron sacrificados 24 horas después de la siempre menor a 0,35 (Tabla 1).
administración de las formulaciones. Para evaluar la

Tabla 1. Tamaño y potencial zeta de los poliplejos en las distintas formulaciones.

Formulaciones Tamaño de partícula (nm) Potencial Zeta (mV)

Formulación 1 134 ± 6 26 ± 1

Formulación 2 129 ± 19 3±0

Formulación 3 216 ± 13 5±2

Formulación 4 100 ± 19 26 ± 0

Formulación 5 179 ± 18 25 ± 0

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