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murino), utilizadas en los ensayos in vitro, se obtuvieron Mercedes Fructuoso, Laura Blanco, Conchita Tros de Ilarduya
de American Type Culture Collection, MD (EE.UU.). Se
mantuvieron a 37ºC con un 5% de CO2 en un incubador Formulación 1
Forma Scientific, Inc, CO2 Water Jacked Incubator 3121
(EE.UU.), y crecieron en DME-10, Dulbecco’s Modified PEI 25
Eagle Medium-High Glucose con 4500 mg/L de glucosa y
Glutamax-I, suplementado con un 10% de suero fetal Formulación 2
bovino (FBS), 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml
de estreptomicina. Como tampón fosfato se utilizó PBS PEI 25 + transferrina (32 µg/µg ADN)
(pH 7,4, 0,15 M). Todos los productos se obtuvieron de
Gibco BRL (Reino Unido). Formulación 3
2.2. Métodos PEI 25 + transferrina (32 µg/µg ADN) + protamina
(0,5 µg/µg ADN)
2.2.a. Purificación del ADNp
Formulación 4
El plásmido utilizado en los experimentos fue el
pCMV-Luc. Para su crecimiento y purificación se tomó PEI 25 + asialofetuína (0,5 µg/µg ADN)
una unidad formadora de colonias de una cepa de
Escherichia coli modificada y se hizo crecer primero en 5 Formulación 5
ml de precultivo LB Broth (1% p/v de triptona, 0,5% p/v
de extracto de levadura y 1% de NaCl) con 50 µg/ml de PEI 25 + asialofetuína (0,5 µg/µg ADN) + protamina
kanamicina durante 4 horas a 37ºC y después en 2 L del (0,4 µg/µg ADN)
mismo medio durante 12 horas a la misma temperatura y
en agitación en un agitador Shaker 625, New Brunswick Formulación 6
Scientific, Co. Inc, Edison (EE.UU). Tras la centrifugación
de las bacterias a 6000 g y 4ºC durante 15 minutos en una DOTAP/Colesterol
centrífuga Beckman J2-HS, la purificación se llevó a cabo
con el Quiagen EndoFree® Plasmid Giga Kit de acuerdo Formulación 7
con el protocolo del fabricante hasta conseguir el
plásmido, que fue resuspendido en 1 ml de agua estéril. La DOTAP/Colesterol + transferrina (32 µg/µg ADN)
determinación de la pureza y concentración del plásmido
se realizó utilizando el NanoDrop™ ND-1000 de Thermo Formulación 8
Fisher Scientific Inc. (EE.UU.).
DOTAP/Colesterol + transferrina (32 µg/µg ADN) +
2.2.b. Preparación y caracterización físico-química de los protamina (0,5 µg/µg ADN)
vectores lipídicos y poliméricos
Formulación 9
En la preparación de los poliplejos, se partió del
polímero PEI 25 (10 mM) que se disolvió en agua estéril DOTAP/Colesterol + asialofetuína (0,5 µg/µg ADN)
(pH 7,4, HCl 1 N), se filtró por un dispositivo Millipore
0,22 µm Corning® N414831 (Alemania) y se conservaron Formulación 10
a 4ºC hasta su utilización. Para la preparación de los
liposomas, DOTAP: Colesterol (1:0,9), se partió de una DOTAP/Colesterol + asialofetuína (0,5 µg/µg ADN) +
solución de lípidos (5 mg/ml) en cloroformo. Tras la protamina (0,4 µg/µg ADN)
eliminación del disolvente a presión reducida mediante el
uso de un rotavapor, el film de lípidos resultante se hidrató Todas las formulaciones están realizadas con una
con tampón HEPES 10 Mm (pH 7,4) glucosado al 10% concentración de ADN de 10 µg/ml.
(p/v). Las vesículas resultantes se filtraron a través de una
membrana de policarbonato con un tamaño de poro de 100 Los ligandos transferrina y asialofetuína, y el péptido
nm de diámetro, y de dos filtros de apoyo (Avanti, Polar protamina, se adicionaron siempre a DOTAP/Colesterol o
Lipids, Inc. (EE.UU.)). Finalmente, los liposomas se a PEI 25, según la formulación. Después de 15 minutos de
almacenaron a 4ºC hasta su utilización. incubación a temperatura ambiente, se añadió la cantidad
de plásmido y tampón HEPES (c.s.p 200 µl) y se mezcló
Los complejos poliméricos para los ensayos in vitro se suavemente.
realizaron a una relación PEI 25/ADN N/P 4, añadiéndose
4 grupos protonables por cada grupo fosfato negativo del En cuanto a la caracterización fisicoquímica, el tamaño
ADNp. Por otro lado, los lipoplejos, se prepararon a una de partícula y el potencial zeta (carga superficial), tanto de
relación de cargas lípido/ADN (+/-) 5/1. En total se los liposomas como de los lipoplejos y los poliplejos, se
realizaron 10 formulaciones por simple mezcla de los determinaron en búffer HEPES glucosado por
componentes, 5 de poliplejos y 5 de lipoplejos, que se difractometría de láser utilizando un analizador de
describen a continuación: partículas denominado Zetasizer Nano Series (Malvern
Instruments Inc., Reino Unido). Las medidas se realizaron
por triplicado.
2.2.c. Estudios de transfección in vitro
Para los estudios in vitro se utilizaron células HepG2
(hepatocarcinoma humano), HeLa (cáncer cérvico-uterino
humano) y CT-26 (cáncer de colon murino). Se platearon
1 x 105 células por pocillo en placas Costar® 3548, 48
WellCell Culture Cluster (EE.UU.), suspendidas en DME-
10, 300 µl de DME-10 y 200 µl del complejo
correspondiente (conteniendo 1 µg de ADN). Tras 4 horas
de incubación a 37ºC y 5% de CO2, se retiró el medio de
transfección y se añadió DME-10 para la expresión del gen
de la luciferasa durante 48 horas. Posteriormente, las
células se lavaron con PBS y se lisaron con 100 µl de
buffer de lisis 1X (RLB, Reporter Lisis Buffer), de
Promega (EE.UU.). A continuación, se sometieron a dos
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