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importantes avances con miras a mejorar la capacidad
predictiva de los ensayos in vitro de hepatotoxicidad
humana. En la presente sección se muestran ejemplos de la
contribución de diferentes modelos in vitro a la hora de
evaluar y anticipar el riesgo potencial de hepatotoxicidad
de los fármacos, así como para ampliar el conocimiento de
los mecanismos implicados en la toxicidad y ayudar a la
comprensión de los factores que determinan la
susceptibilidad individual.
5.1. Predicción del potencial hepatotóxico
Las líneas de hepatoma HepG2 y HepaRG y los
hepatocitos humanos en cultivo primario son los modelos
celulares más utilizados en la actualidad por la industria
farmacéutica para evalular hepatotoxicidad de nuevas
moléculas (34). Su uso combinado con ensayos
multiparamétricos ha permitido desarrollar herramientas
muy potentes que cada vez tienen mayor aceptación en los
estudios de seguridad de fármacos. Recientemente se han
propuesto diferentes ensayos HCS que han mostrado gran
especificidad y selectividad para identificar compuestos
con capacidad de inducir daño hepático (5,47,50). La
mayor parte de estos ensayos utilizan células HepG2
expuestas al compuesto a estudiar y sobre las que se
analizan no sólo eventos de toxicidad tardía (viabilidad
celular), sino también en otros parámetros indicativos de
toxicidad temprana (generación de ROS, aumento de
calcio intracelular, disfunción mitocondrial, cambios
nucleares, etc). Las plataformas HCS automatizadas
integran de forma rápida los datos obtenidos a partir de
diferentes indicadores de función celular y pueden
incorporarse fácilmente y con alto rendimiento en los
procesos de cribado de compuestos, facilitando la
identificación temprana de aquellos con potential
hepatotóxico y contribuyendo al desarrollo de fármacos
más seguros (5,46). La metabolómica también se ha
mostrado como una estrategia sensible y eficaz para
evaluar efectos tóxicos sobre células en cultivo (42,45),
aunque su elevada exigencia desde el punto de vista
técnico supone una importante limitación para el cribado
de largas series compuestos. No obstante la
toxicometabolómica puede aplicarse de forma
complementaria a otras plataformas, por ejemplo los
ensayos HCS, para confirmar la toxicidad en moléculas
seleccionadas y puede aportar información de gran valor
en la propuesta de biomarcadores de hepatotoxicidad.
Las estrategias multiparamétricas basadas en el examen
de una batería de marcadores pre-letales ofrecen la
posibilidad de detectar cambios sutiles relacionados con la fluoróforos con longitudes de onda de absorción y emisión
toxicidad con mayor sensibilidad que los ensayos de
convencionales que detectan sólo citotoxicidad manifiesta
(5,50). Ello hace posible detectar alteraciones inducidas a informan de forma simultánea sobre un conjunto de
concentraciones más bajas del compuesto y, por tanto, más
cercanas a los niveles del fármaco alcanzados en el plasma
o el tejido hepático durante su administración terapéutica,
lo que permite obtener información relevante desde el
punto de vista clínico. El uso de bajas concentraciones
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
permite además el diseño de estudios de toxicidad a largo
plazo con adiciones repetidas de los fármacos para imitar
un régimen de dosificación crónica en la administración de
fármacos (14). Un valor añadido de las evaluaciones
multiplexadas es que no sólo se obtiene información sobre
múltiples parámetros celulares, sino que también se
pueden establecer relaciones entre diferentes parámetros
medidos en la misma célula, lo que podría contribuir a
interpretar mejor los cambios observados.
5.2. Clasificación de los mecanismos de hepatotoxicidad
Los ensayos generales de hepatotoxicidad permiten la
identificación de compuestos capaces de inducir daño
celular, independientemente del mecanismo implicado en
su toxicidad. Con la finalidad de discriminar los
compuestos que actúan a través de un mecanismo
particular, se analizan diversos parámetros específicos que
incluyen marcadores de daño a biomoléculas, alteraciones
bioquímicas, alteración de la homeostasis celular,
desregulación metabólica, alteración de actividades
enzimáticas o de transporte y deterioro estructural o
funcional de los componentes celulares (14). Este
conocimiento mecanístico es relevante para mejorar la
evaluación del balance eficacia/seguridad de los fármacos;
sin embargo, los ensayos convencionales miden de forma
individualizada un único parámetro, por lo que se requiere
la aplicación de una batería de tests, lo que dificulta y
enlentece la obtención de información (5).
Una estrategia útil para obtener una visión preliminar
del mecanismo implicado en la hepatotoxicidad de un
fármaco o grupo de fármacos es la evaluación combinada
de múltiples parámetros, cada uno indicativo de un
mecanismo concreto. Los ensayos HCS basados en la
medida simultánea de parámetros que informan sobre
alteraciones celulares clave (por ejemplo, apoptosis, estrés
oxidativo, desregulación de la homeostasis del calcio,
disfunción mitocondrial, etc.) son una buena alternativa.
Una vez sugerido un mecanismo(s) particular(es), el
análisis posterior de marcadores específicos ayuda a
completar la información. Para ello, se han propuesto
diferentes ensayos HCS dirigidos a examinar de forma
específica los principales mecanismos implicados en la
hepatotoxicidad: estrés oxidativo, toxicidad mitocondrial,
genotoxicidad, esteatosis, colestasis, fosfolipidosis (ver
revisión en 47). La información aportada por estos ensayos
viene limitada por la necesidad de incubar las células con
una mezcla de marcadores fluorescentes ópticamente
compatibles. Mediante una adecuada selección de
no superpuestas es posible diseñar baterías de colorantes
(combinaciones de hasta cinco sondas fluorescentes) que
alteraciones celulares relacionadas con el mecanismo
estudiado (Figura 5) (48,49).
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