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Ana García Aguilar, Carlos Guillén Viejo, Manuel Benito de las Heras

hielo y tras agitación fueron centrifugados (15 min, 15,000 Para la detección de los anticuerpos se usó el método
× g, 4ºC). Se recogió el sobrenadante con el lisado de quimioluminiscencia. Las membranas se incubaron con
proteico. A continuación, se valoraron las proteínas por el ECL Plus Western Blotting Detection durante 5 minutos, y
método de Bradford. se revelaron en el ChemiDoc por detección de
quimioluminiscencia.
Las muestras son desnaturalizadas (3 min, 95ºC) y
cargados 15-30 µg por muestra en geles de poliacrilamida. 2.3.b. Inmunoprecipitación
Para el desarrollo de la electroforesis se utilizó el siguiente
tampón: Tris-base 25 mM, glicina 190 mM y SDS 0.1% De los extractos proteicos de cultivos celulares se
(p/v) pH 8.3, a un voltaje constante de 100-140 v durante preparan muestras con una cantidad de proteína uniforme
1.5-2 horas. Una vez finalizada la electroferesis, los geles (150-400 µg de proteína) en un volumen final de 500 µl
se transfirieron a membranas de PVDF (polifluoruro de ajustado con tampón de lisis, se añadió el anticuerpo de
vinilideno) previamente activadas con metanol. interés para inmunoprecipitar (1-2 µg de anticuerpo), y se
mantuvo toda la noche en rotación a 4ºC. Al día siguiente,
El tampón de transferencia usado fue 25 mM Tris,192 para quedarse con toda la proteína que se ha unido al
mM glicina, metanol 20% (v/v). La electrotransferencia anticuerpo, se añadió el extracto proteico 20-30 µl de una
fue llevada a cabo con un voltaje constante de 100 v, mezcla de proteína A al 50% (Roche) con tampón de lisis
durante una hora y diez y en frío. Finalizada la (1:1, previamente lavada varias veces con el tampón) y se
transferencia, se bloquearon las membranas en TTBS incubaron de 1 a 2 horas a 4ºC.
suplementado con 5% (p/v) de leche en polvo desnatada
durante 1 hora a temperatura ambiente, con agitación La fase sedimentada (con la proteína A conjugada con
suave. la agarosa) se lavó varias veces con 500 µl de tampón de
lisis, dejando en un último paso el precipitado lo más seco
Posteriormente se retiró la solución de bloqueo y se posible. Después, se añadió el mismo volumen de tampón
incubó con el anticuerpo primario diluido en TTBS hasta de Laemmli 2X que el ocupado por la fracción de agarosa.
el día siguiente, en una cámara fría a 4ºC, con agitación Las muestras se cargan en geles de electroforesis para su
suave. La lista con todos los anticuerpos primarios y sus detección por western-blot.
diluciones se encuentra en la sección materiales.
2.4. Análisis estadístico
Al día siguiente, la membrana se lavó 3-5 veces con
TTBS durante una hora en agitación fuerte, tras la cual se Los resultados se expresan como media ± desviación
incubó con una solución en TTBS de anticuerpo estándar. El análisis estadístico se realizó con el programa
secundario frente a la especie correspondiente en la que se GraphPad Prism 5. Se utilizó one-way ANOVA para
hubiese generado el anticuerpo primario. La incubación comparación múltiple (Bonferroni’s post-test), o bien, para
con el anticuerpo secundario fue de 1 h a temperatura análisis comparativo de dos datos, el t test (unpaired).
ambiente en agitación suave.Finalmente, se volvió a lavar Como valor de discriminación de diferencias
con TTBS otras 3-5 veces durante aproximadamente una estadísticamente significativas se utiliza p=0.05
hora, en agitación fuerte.
2.5. Materiales

2.5.a. Listado de anticuerpos primarios

Anticuerpo Casa comercial (Ref) Origen Dilución
(Uso)
P-ACC (S79) Cell Signaling (#3661) IgG rabbit
Acetylated-Lysine Cell Signaling (# 9441) IgG rabbit 1:1000 (WB)
1:1000 (WB);
ß-actina (AC-74) Sigma-Aldrich (A5316) mAbIgG1 1:100 (IP)
mouse 1:5000 (WB)
Flag Sigma-Aldrich (F1804)
mAb IgG1 1:1000 (WB)
GFP (B-2) Santa Cruz Biotechnology Mouse IgG
(sc-9996) 1:1000 (WB)
HA Sigma-Aldrich (H6908) mAb
Mouse 1:1000 (WB);
LC3B Cell Signaling (#4108) 1:100 (IP)
Nitrotirosina Merck Millipore (#06-284) IgG Rabbit 1:1000 (WB)
p62/SQSTM1 Progen (GP62) 1:1000 (WB)
p70S6K Cell Signaling (#9202) IgG Rabbit 1:1000 (WB)
PGC-1a (3GS) Cell Signaling (#2178) IgG Rabbit 1:1000 (WB)
432 IgG Guinea pig 1:1000 (WB)
IgG Rabbit
IgG Rabbit

@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain