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Tuberin protein: therapeutic target to activate autophagy and mitophagy avoiding the progression to type 2 diabetes
LC3C) y la de la proteína asociada al receptor gamma-
ácido amino butírico (GABARAP, GABARAPL1 y
GABARAPL2) (28). Existen dos formas de LC3, LC3-I es
la forma no lipidada y que se encuentra libre en el
citoplasma; y LC3-II es la forma lipidada (conjugada con
fosfatidiletanolamina) esencial para el proceso de la
autofagia y localizada en la membrana de los
autofagosomas. La conversión de LC3 es un método muy
común para la evaluación experimental de la activación del
flujo autofágico. Otras proteínas, entre ellas p62/SQSTM1
(secuestrosoma 1), contienen secuencias que interaccionan
con LC3 y sirven como adaptadoras entre estructuras
proteínas ubiquitinadas y orgánulos dañados y la
maquinaria autofágica.
Debido a que una autofagia defectiva contribuye al
desarrollo de enfermedades neurodegenerativas
(enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la
enfermedad de Huntington y la esclerosis lateral
amiotrófica), se propone a las moléculas activadoras de
autofagia o la restricción calórica como potenciales
estrategias terapéuticas para atenuar la progresión de
dichas enfermedades (29).
1.5.c. Autofagia específica de mitocondrias (mitofagia)
Las mitocondrias juegan un papel esencial en
numerosos procesos bioenergéticos en las células
eucariotas, proveyendo de energía que se genera a través
de la fosforilación oxidativa. Las mitocondrias constituyen
una red interconectada de alta plasticidad y dinámica, con
un número relativamente constante de las mismas
mantenido por un balance entre eventos opuestos de
biogénesis mitocondrial y mitofagia.
Frente a un daño mitocondrial, se pierde el potencial de
membrana mitocondrial y se induce el proceso
denominado mitofagia. Las mitocondrias dañadas
acumulan una proteína en la membrana externa
mitocondrial denominada PINK1 (quinasa 1 inducida por
PTEN), la cual recluta a una ubiquitina-proteína ligasa E3
citosólica denominada PARK2/Parkin, que media la
ubiquitinación de proteínas mitocondriales. Estas son
reconocidas por otras proteínas adaptadoras (p62 y
HDAC6) las cuales unen LC3 unido a PE (forma lipidada),
iniciando la degradación (30). Este proceso es selectivo, y
no ocurre en mitocondrias “sanas”, ya que éstas son
capaces de importar PINK1 y degradarlo por la proteasa
PARL (proteína romboidea asociada a presenilinas), de
una forma dependiente de potencial de membrana,
inhibiendo así el proceso de mitofagia (31).
2. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. Líneas celulares y medios de cultivo
Se usó la línea de células ß pancreáticas MIN6
originaria de insulinoma murino (Miyazaki et al., 1990),
cultivada en DMEM (glucosa 4,5 g/l) y suplementado con
suero fetal bovino (FBS) al 15% y 2-mercaptoetanol 50
µM (como agente protector frente al daño oxidativo).
Además, a partir de ésta, se generaron otras dos líneas de
forma estable MIN6-Scrambled-shRNA y MIN6-
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
TSC2shRNA mediante infección lentiviral y selección con
geneticina.
También, fueron usadas las células embrionarias de
riñón humanas (HEK 293T) y fibroblastos embrionarios
murinos (MEFs), cultivados en DMEM (4,5 g/l) y
suplementados con FBS 10% y HEPES. Las células MEF
Tsc2 -/- así como sus controles MEF Tsc2 +/+ fueron
generosamente proporcionadas por Dr. Kwiatkowski
(Harvard Medical School, Boston, EE.UU.). Por último,
las células MEF Sirt1 -/- así como sus controles MEF Sirt1
+/+ procedían del cultivo primario y fueron generosamente
proporcionadas por la Dra. María Monsalve (IIB, CSIC,
Madrid).
2.2. Técnicas de ADN recombinantE
2.2.a. Cultivo de bacterias
Para la producción de ADN plasmídico recombinante
se utilizaron bacterias ultracompetentes E.coli XL2-Blue.
Las bacterias fueron crecidas en placas Petri con agar
bacteriológico 1.5% (p/v) en medio LB, Luria Bertoni:
NaCl (10 g/l), triptona (10 g/l), extracto de levadura (5
g/l). El medio fue autoclavado, y enfriado hasta 55ºC para
la adición de antibióticos: ampicilina (100 µg/ml) o
kanamicina (50 µg/ml). Entre 20-25 ml fueron vertidos por
placa Petri, sobre la cual, una vez solidificado el medio, se
sembraron las bacterias por estrías con un asa de Kolle.
Todas las inoculaciones para amplificación de
plásmidos provinieron de colonias únicas seleccionadas de
placas de agar con antibiótico.
2.2.b. Purificación de plásmidos
Los plásmidos fueron purificados de cultivos
bacterianos por el método de la lisis alcalina. Para ello, se
utilizó el Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Alemania),
siguiendo las instrucciones del fabricante y usando las
soluciones incluidas para obtener de una forma rápida y
sencilla y con un alto rendimiento un DNA de gran
calidad.
Finalmente, el DNA purificado se deja secar al aire
libre durante 5-10 minutos para que se evapore el etanol, y
se resuspende en agua destilada, donde se mantiene a 4ºC
de manera estable hasta su uso.
2.2.c. Experimentos de transfección y co-transfección
transitoria
Las células fueron sembradas de manera semi-
confluente, y al día siguiente fueron transitoriamente
transfectadas y/o co-transfectadas con diferentes plásmidos
usando tres métodos diferentes:
- Lipofección.
- Electroporación.
- Poliaminas.
2.3. Análisis de la expresión de proteínas
2.3.a. Western-blot
Las células fueron lavadas 2 veces con PBS frío,
colocadas sobre hielo y raspadas con tampón de lisis. El
lisado se pasó a tubos eppendorf y tras 5-10 minutos en
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