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Solid lipid nanoparticles for gene therapy Células no?tratadas

este virus puede ser un buen candidato para el tratamiento 1,5?µg?shRNA74 2?µg?shRNA74
con ARNi a través del silenciamiento de secuencias
específicas de su ARN. En este sentido, la secuencia 2,5?µg?shRNA74 3?µg?shRNA74
denominada “Sitio Interno de Entrada al Ribosoma”
(IRES), que se encuentra en el extremo 5’ de la región no Figura 11. Expresión de IRES-GFP en células Huh-7 tratados
traducida (UTR) y que es necesaria para la síntesis con los vectores preparados con SLNs, AH y cantidades
proteica y por tanto para la replicación del virus, ha sido crecientes de shRNA74. Puede observarse como la eficacia de
propuesta como secuencia diana para la inhibición del silenciamiento aumenta al aumentar la dosis de shRNA74.
virus (85,86).
Posteriormente, evaluamos la eficacia de los vectores
Teniendo en cuenta estas consideraciones, estudiamos en la línea celular de hepatoma humano Huh-7 NS3-3 (87),
la potencial aplicación de los vectores preparados con que porta un replicón subgenómico del virus. Se observó
SLNs, protamina y dextrano o AH, para el tratamiento de una disminución significativa de la cantidad de ARN del
la infección crónica debida al VHC, a los que VHC, indicativo del silenciamiento del IRES-VHC, siendo
incorporamos un plásmido que codifica un ARNi frente al este más elevado cuanto mayor es la dosis de shRNA74.
dominio II de la secuencia IRES-VHC (shRNA74)
(31,32). Puesto que el VHC se replica y acantona en el Estudiamos también la potencial toxicidad de los
interior de los hepatocitos a lo largo de su ciclo de vida, vectores en los dos modelos celulares, y comprobamos que
los estudios in vitro de eficacia de silenciamiento los la viabilidad celular no se veía alterada. Puesto que la
llevamos a cabo en las líneas celulares HepG2 y Huh-7 viabilidad celular por sí sola no es indicativo de toxicidad,
(células de hepatoma de origen humano). Los vectores y teniendo en cuenta una posible administración
fueron internalizados en las células de forma rápida y parenteral, evaluamos el efecto del vector a nivel
eficiente, independientemente del polisacárido empleado, hematológico midiendo el grado de hemólisis y la
siendo el principal mecanismo de entrada la endocitosis capacidad de aglutinación de eritrocitos. El vector no
mediada por clatrinas, y en menor medida la endocitosis mostró actividad hemolítica ni tampoco indujo la
mediada por caveolas. La captación mediada por el aglutinación de eritrocitos indicativo de la
receptor CD44 también estaba implicada, aunque este biocompatibilidad del vector (figura 12). Es importante
mecanismo resultó ser mucho menos eficiente para el tener en cuenta que al AH se le atribuye la capacidad de
silenciamiento. Asimismo, se comprobó que la reducir la interacción de las nanopartículas con
macropinocitosis no intervenía en el proceso de entrada a componentes sanguíneos debido a un impedimento
la célula. Al tratar células HepG2 y Huh-7 con los vectores estérico.
que expresaban IRES-GFP tras un proceso previo de
transfección, se comprobó una disminución del IRES-GFP,
consecuencia del proceso de silenciamiento debido al
shRNA74 incorporado en los vectores.
Independientemente de la presencia de AH o dextrano en
el vector, el silenciamiento incrementaba al aumentar la
dosis; además, resultó ser más eficaz el vector preparado
con AH, que permitió alcanzar, para la dosis más alta (3
µg de shRNA74), un silenciamiento del 60% en las células
HepG2, y un 50% en las células Huh-7. En la figura 11 se
recogen imágenes de las células Huh-7 en las que se puede
observar como la expresión de IRES-GFP disminuye al
aumentar la dosis de shRNA74 en el vector preparado con
AH.

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