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Detección
de
alérgenos
de
cacahuete…

Como
analito
se
seleccionó
una
secuencia
de
86-­-mer
que
codifica
parte
de
la

proteína
Ara
h
2,
característica
del
cacahuete
y
cuya
especificidad
se
comprobó

mediante
el
programa
BLAST
(21).

Se
seleccionó
una
sonda
de
captura
de
32
bases
tiolada
en
el
extremo
5´,

complementaria
en
su
totalidad
con
parte
del
analito
y
una
sonda
indicadora
de
54

nucleótidos
funcionalizada
en
su
extremo
3’
con
biotina.
La
sonda
de
captura
se

diseñó
de
forma
que
hibride
con
la
parte
del
analito
que
queda
libre
en
la

hibridación
con
la
sonda
indicadora,
formando
las
tres
hebras
un
dúplex
perfecto.

De
esta
forma,
se
evita
que
alguna
base
quede
sin
hibridar
y
dé
lugar
a
adsorciones

inespecíficas
sobre
el
electrodo
y
por
tanto
a
errores
en
la
medida.

Para
predecir
las
posibles
estructuras
secundarias
de
las
sondas
y
la
energía

de
hibridación
del
analito
con
la
sonda
de
captura
e
indicadora
se
utilizó
el

programa
informático
Mfold
web
Server
(22).
La
estructura
secundaria
de
la
sonda

de
captura
presenta
una
energía
libre
?G=
-­-2,9
kcal/mol,
la
del
analito
?G
=
-­-16,71

kcal/mol,
la
de
la
sonda
indicadora
?G
=
-­-4,39
kcal/mol,
el
híbrido
analito-­-sonda

de
captura
presenta
una
energía
libre
?G
=
-­-49,8
kcal/mol
y
el
híbrido
analito-­-
sonda
indicadora
?G
=
-­-85,5
kal/mol.
Estos
datos
demuestran
la
hibridación

espontánea
del
analito
con
las
dos
sondas.

3.2.
Selección
de
las
características
del
diseño
de
experimentos

En
la
ejecución
de
un
diseño
de
experimentos
resulta
de
gran
importancia

identificar
adecuadamente
los
factores
o
variables
independientes
que
pueden

afectar
a
la
respuesta
(variable
dependiente)
así
como
sus
niveles
experimentales.

Una
selección
errónea
de
estos
niveles
podría
dar
lugar
a
respuestas
muy
similares

que
no
se
deberían
a
la
no
influencia
del
factor
sobre
la
respuesta
sino

simplemente
a
que
el
factor
no
afecta
en
la
zona
de
trabajo,
pero
puede
hacerlo
si

se
amplía
dicha
zona.

Se
comenzó
por
optimizar
la
composición
de
la
monocapa,
considerando

como
factores
las
concentraciones
de
sonda
de
captura
y
de
mercaptohexanol.
Al

seleccionar
los
niveles,
hay
que
intentar
conseguir
una
SAM
homogénea
y
no

demasiado
compacta
de
forma
que
se
permita
el
contacto
entre
las
hebras

complementarias
(23).

Experiencias
previas
demostraron
que
una
concentración
de
sonda
de

captura
inferior
a
0,1
µM
producía
defectos
en
la
monocapa
quedando
zonas
de

oro
no
cubiertas.
Por
otra
parte,
se
requiere
un
exceso
de
sonda
de
captura
en

relación
al
híbrido
analito-­-sonda
indicadora
con
el
fin
de
asegurar
que
todo
el

analito
incorporado
va
a
poder
reaccionar
con
la
sonda
de
captura
para
formar
el

híbrido
final.
Teniendo
esto
en
cuenta
se
consideraron
como
límites

experimentales
0,1
y
2
µM.

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