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VOL. 74 (4) NANOCOMPLEJOS DEL RECEPTOR PARA...

Los dominios transmembrana tienen un papel fundamental en las
interacciones entre las subunidades TCRa/ß y CD3 (4-6). Por lo tanto, la
elección de detergente es crítica para el mantenimiento de las
interacciones. El detergente debe también ser lo suficientemente eficaz

como para disolver la membrana alrededor del complejo proteíco. Por
otro lado, no se debe asumir que el TCR deba existir en un complejo

único. Por lo tanto, la aproximación experimental para estudiar un
complejo multiproteíco debería poder discriminar entre complejos con

diferentes estequiometrías.
Se aplicó la electroforesis en condiciones nativas basada en azul

Coomasie (Blue native polyacrylamide gel electrophoresis, BN-PAGE)
(21, 22) con diferentes detergentes al estudio del tamaño y estequiometría

del TCR (23, 34). Al contrario que los experimentos de co-precipitación y
de FRET, el sistema BN-PAGE permite determinar la abundancia relativa

y el número de complejos diferentes producidos por una proteína dada. Es
más, los complejos se forman en condiciones nativas, lo que permite la

interacción con otras proteínas tales como chaperonas, así como
modificaciones postraduccionales. Cuando el TCR fue extraido en

digitonina a partir tanto de linfocitos primarios como de líneas celulares
de ratón y humanas, se detectó un único complejo (23-25). Este complejo

resultó ser monovalente, con la estequiometría aß?ede??. Por el
contrario, los detergentes Brij96 y Brij98 permitieron la separación de

varios complejos de tamaño diferente (23, 24). Una serie de controles
excluyeron que el Brij96 causara una agregación artificiosa del TCR (23).

Se demostró que los complejos grandes estaban en la membrana
plasmática y que se fosforilaban en tirosina tras la estimulación con

pMHC. Además, experimentos de coprecipitación a partir de células que
expresan dos TCRs diferentes (esto es, con dos heterodímeros TCRa/ß
distintos), demostraron que ambos TCRs podían ser coprecipitados si se
habían extraído en Brij96, pero no si se habían extraído en digitonina

(23). Estos datos eran por lo tanto compatibles con que los complejos
aislados en Brij96 contenían TCR multivalentes, mientras que en

digitonina eran exclusivamente monovalentes.
La coexistencia de complejos TCR con diferentes valencias

identificados por BN-PAGE en Brij96 y otros detergentes está de acuerdo
con los datos de FRET previamente mencionados en células intactas. Es

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