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ÁGUEDA GONZÁLEZ-RODRÍGUEZ Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.
Determinación de las actividades caspasa-3 y caspasa-8
Las actividades caspasa-8 y 3 se determinaron por un método
fluorimétrico siguiendo el protocolo descrito por González-Rodrí-
guez y col., 2007 (13).
RT-PCR
Una vez sintetizado el cDNA (kit High-capacity archive kit de
Applied Biosistem); la PCR se realizó con Power SYBR green PCR
mastermix en el servicio de secuenciación del IIB. El programa rea-
lizado fue el Standard 10 minutos a 95º C y (15 segundos a 95º C;
1 minuto a 60º C) en 40 ciclos. Además, el ensayo se realizó con una
curva de disociación a 90º C, 15 segundos. Los oligonucleótidos uti-
lizados fueron: Bid sense: CTT GGT TAG AAA CGA GAT GGA CTG
A y Bid antisense: TGT TCT CTG GGA CCT GTC TTC AG.
Inducción de daño hepático fulminante in vivo
Ratones de genotipos salvaje y deficientes en S6K1 fueron inyec-
tados con Concanavalina A (25 mg/Kg peso) disuelta en PBS a través
de la vena de la cola (14). Transcurridas 8 horas, se sacrificaron los
animales y se extrajo el hígado.
Análisis histológico
Los hígados de ratón fueron fijados con paraformaldehído por
perfusión del animal previa hepatectomía. Dichos hígados, tras ser
extirpados, fueron incluidos en parafina, cortados con un espesor de
4 micras y teñidos con eosina-hematoxilina; el análisis histológico se
realizó por microscopia óptica.
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