Page 51 - 74_03

VOL. 74 (3), 325-344, 2008 PAPEL DE LA PROTEÍNA RIBOSOMAL S6K1...

expresaban la proteína viral LTAg. Transcurridas 48-72 horas se
retiró el medio que contenía las partículas virales y las células in-
fectadas se seleccionaron mediante el cultivo en medio DMEM su-
plementado con 10% de suero fetal bovino y con el antibiótico pu-
romicina (1 µg/ml). Transcurridos quince días en cultivo en estas
condiciones, se caracterizaron genotípica y fenotípicamente los he-
patocitos inmortalizados (11).

Caracterización de los hepatocitos neonatales inmortalizados
por inmunofluorescencia y microscopía confocal

Los hepatocitos inmortalizados S6K1+/+ y S6K1–/– se cultivaron en
placas de cultivo que contenían cristales de vidrio. Una vez alcan-
zado el 60-80% de confluencia, se fijaron las células y se incuba-
ron con los anticuerpos primarios anti-albúmina, anti-carbamoíl
fosfato sintetasa (CPS) y anti-vimentina (VIM) seguido de incuba-
ción con los anticuerpos secundarios correspondientes (FITC-con-
jugated sheep anti-mouse y Cy3-conjugated gota anti-rabit). El aná-
lisis de inmunofluorescencia se realizó en un microscopio confocal
MRC-1024 (Bio-Rad) adaptado a un microscopio invertido Nikon
Eclipse TE 300.

Análisis de la expresión de proteínas mediante Western blot
Se ha seguido el protocolo descrito por Valverde y col., 2004 (12).

Determinación del porcentaje de células apoptóticas

Una vez finalizado el tratamiento con los estímulos apoptóticos,
las células se recogieron mediante centrifugación a 2.500 rpm du-
rante 5 minutos a 4º C. El porcentaje de células apoptóticas se de-
terminó fijando las células con etanol al 70% seguido de incubación
con RNAsa A y ioduro de propidio (0,1% en PBS).

329