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ÁGUEDA GONZÁLEZ-RODRÍGUEZ Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

de los resultados, nos planteamos la posibilidad de la existencia de
un efecto directo o indirecto de la proteína S6K1 sobre la expresión
de la proteína proapoptótica Bid.

Estudio de la apoptosisis inducida por la activación
de receptores de muerte

A partir de este momento trabajamos únicamente con líneas
celulares inmortalizadas de hepatocitos de ratón neonato S6K1+/+
y S6K1–/–.

Para realizar el estudio de la apoptosis inducida por la activación
de receptores de muerte, estimulamos las células por un lado con
TNFa (30 ng/ml) y actinomicina D (0,2 µg/ml) y por otro con Jo2
(2 µg/ml), un anticuerpo agonista del receptor de muerte FAS, y
trancurridas 16 horas analizamos diferentes parámetros indicadores
de la apoptosis celular. En primer lugar, realizamos el estudio dife-
rencial de la activación de la apoptosis a través de estímulos de la vía
de receptores de muerte en los hepatocitos S6K1+/+ y S6K1–/– anali-
zando la morfología celular tras el tratamiento con los distintos es-
tímulos que activan esta ruta apoptótica. Los hepatocitos S6K1+/+
adquieren una morfología típica de las células apoptóticas tras so-
meterlos a los estímulos ya citados y, por el contrario, los hepatoci-
tos carentes en S6K1 no cambian su apariencia tras la estimulación
(Figura 3A). Al determinar la morfología nuclear antes y después de
la estimulación mediante tinción con DAPI, observamos que no apa-
recen o aparecen de forma muy puntual cuerpos apoptóticos en los
hepatocitos deficientes en S6K1 (Figura 3B).

A continuación, medimos el porcentaje de células apoptóticas
(con contenido de ADN inferior a 2N) en las mismas condiciones
experimentales. Al analizar por citometría de flujo el porcentaje de
células apoptóticas, encontramos que las células S6K1+/+ son sensi-
bles a la apoptosis inducida con ligandos de receptores de muerte,
ya que al ser estimuladas con TNFa en presencia de Actinomicina D,
el porcentaje de células con contenido de ADN inferior a 2N aumen-
ta siete veces con respecto a su control no inducido. De la misma
manera, tras la estimulación con Jo2 observamos un aumento en
este procentaje de tres veces con respecto al control no estimulado.

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