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VOL. 73 (1), 47-64, 2007 REGULACIÓN EPIGENÉTICA EN LA PANCREATITIS NECRÓTICA AGUDA

a la que no se le añade anticuerpo (No Ab). A continuación, las
muestras se incuban con 50 µL de proteína A+G-sefarosa, se lava y
se desentrecruza durante toda la noche. Por último se purifica el
DNA con el PCR purification Kit (Quiagen) de acuerdo con las ins-
trucciones del fabricante y se almacena a –20º C hasta su análisis
por PCR. Los oligonucleótidos usados para las PCR fueron: egr1
(promotor): 5’-GTAGAACCCCGGCCTGACTC-3 y 5’-AGGCTCCT-
GGAGTTCCCAGC-3’; egr1 (zona codificable): 5’-CTTGCCCTGTTGAG-
TCCTGC-3’ y 5’-CACAGGCAAAAGGCTTCTCG-3’; icam1 (promotor):
5’-GGGATGGCCGTCCTGACTA-3’ y 5’-GCCACTTTCCCGGAAACCT-3’;
icam1 (zona codificable): 5’-TGTCGGTGCTCAGGTATCCA-3’ y 5’-TT-
CACCTGCACGGATCCA-3’; tnfa (promotor): 5’-GGTGAGGACGGAGA-
GGAGATT-3’ y 5’-TGGGAGTTAGTACCAGGGTGTTC-3’; tnfa (zona
codificable): 5’-CAGCCGATTTGCCATTTCAT-3’ y 5’-TCCTTAGGGCA-
AGGGCTCTT-3’; ß-actina (promotor): 5’-GCCGTTCCGAAATTGCCT-
3’ y 5’-ACGTCCCTGCTTACCTGGTG-3’; ß-actina (zona codificable):
5’-AGAGCAAGAGAGGCATCCTG-3’ y 5’-GGGTCATCTTTTCACGGTT-
GG-3’; a-actina (promotor): 5’-AGGGACTCTAGTGCCCAACACC-3’ y
5’-CCCACCTCCACCCTACCTGC-3’; a-actina (zona codificable): 5’-
AGGATTCCTACGTGGGCGAC-3’ y 5’-AGAGAGACAGCACCGCCTG-3’;
Región intergénica 5’-TGCCGGTTATCACTCTCTCATGC-3’ 5’-GGT-
CTTGGTTCAGTCTTCACATGC-3’.

3. Aislamiento y análisis de RNA

La extracción de RNA total de tejido pancreático se realizó utili-
zando RNA later (Ambion) cuya función es estabilizar el RNA. La
extracción total de RNA se lleva a cabo mediante el Kit mini RNA
total extraction (Quiagen) según las indicaciones del fabricante. El
cDNA de las muestras se amplifica por PCR utilizando los oligo-
nucleótidos de la región codificable de los genes de interés. Las
reacciones de PCR cuantitativo en tiempo real de las muestras de
cDNA se realizaron en termociclador ABI GeneAmp 7000 Sequence
Detection System (Perkin-Elmer, Applied Biosystems) usando como
agente fluorescente Syber Green PCR Master Mix (PE Applied Biosys-
tems). Cada reacción se llevó a cabo por triplicado y las curvas de
fusión se construyeron mediante el programa Dissociation Curves
software (Applied Biosystems), para asegurar que sólo se amplifica

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