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BEATRIZ CUBELOS Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

Producción de anticuerpos ANTI-GLYT1

Los anticuerpos policlonales se produjeron inmunizando cone-
jos con la proteína de fusión Glutation-S-Transferasa que contenía
los 37 aminoácidos del extremo amino terminal de GLYT1b para el
anticuerpo número 224. La inmunización se realizó en conejos MDL
Nueva Zelanda (Navarra, España), con proteína de fusión y el
coadyuvante de Freund completo. Los conejos fueron reinmunizados
cada dos semanas con la proteína de fusión que en esta ocasión
había sido emulsionada con el adyuvante de Freund incompleto.
Tras varias inmunizaciones se extrajeron los sueros y los anticuerpos
se purificaron por columnas de afinidad (11). La proteína de fusión
unida a GST y la propia proteína GST en una solución de Na-HE-
PES, pH 8,0 se acoplaron a columnas de Affi-Gel 15 siguiendo las
instrucciones del fabricante. El suero generado por el conejo contra
la proteína de fusión se pasó en primer lugar por la columna que
tenía adsorbida la proteína GST y posteriormente por la columna
que contenía la proteína de fusión.

Biotinilación del anticuerpo ANTI-GLYT1

El anticuerpo anti-GLYT1 (número177) se biotiniló con 250 µg
de éster de succinimida-biotina (Pierce, USA) por mg de anticuerpo.

Anticuerpos comerciales y cedidos

Los anticuerpos secundarios unidos a biotina o peroxidasa eran
de Amersham y los unidos a fluoróforos eran de Molecular Probes.
El anticuerpo anti-HA era de DABCO (Berkeley Antibody Company)
y el anticuerpo anti-Myc fue cortésmente cedido por el laboratorio
del Dr. Balbino Alarcón (CBM-SO). La detección de los miembros
del complejo Mint/MALS/CASK se realizó mediante anticuerpos
monoclonales de BD Transduction.

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