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VOL. 72 (1), 5-25, 2006 HIPÓTESIS GLUTAMATÉRGICA DE LA ESQUIZOFRENIA...

Ensayo de Pull Down

Las células COS-7 transfectadas con los vectores de expresión de
las proteínas (PSD-95, MALS o Mint) se solubilizaron en 50 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 0,5% Triton X-100, 100 mM NaCl y 1 mM EDTA
durante 30 minutos a 4º C. El material solubilizado obtenido tras
centrifugación a 14.000 rpm durante 15 minutos fue preincubado
con 100 µl de bolas de glutation agarosa al 50% (v/v) durante una
hora con rotación en la noria a 4º C. Tras una centrifugación los
sobrenadante se transferían a un tubo limpio y se incubaran con
GST, GST-GLYT1Ct o GST-GLYT1Ctdel durante la noche con ro-
tación constante a 4º C. Posteriormente, las bolas fueron lavadas
con PBS frío tres veces y se les añadió 50 µl de tampón de carga
Laemmli. Las muestras se hirvieron durante cinco minutos para rom-
per la unión de las proteínas a las bolas y luego se sometieron a una
electroforesis seguida de inmunotransferencia.

Electroforesis y Western Blot

Tras la determinación de la concentración de proteínas en las
muestras. La electroforesis se llevaba a cabo en gel de poliacrilamida
y SDS, en condiciones reductoras, en presencia de 2-mercaptoetanol.
Los geles se corrían lentamente durante la noche mediante una
corriente constante de 30V. Tras la electroforesis, las muestras eran
transferidas a una membrana de nitrocelulosa por el sistema de
electroblotting semi-seco (LKB) a 1,2 mA/cm2 durante dos horas.
La solución de transferencia que se usaba contenía 192 mM glicina
y 25 mM Tris-HCl, pH 8,3.

La unión inespecífica a la membrana se bloqueó por incubación
con 5% leche desnatada en 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5,
durante cuatro horas a 25º C. Posteriormente la membrana se incubó
con el antisuero o anticuerpo purificado a la concentración idónea du-
rante toda la noche a 4º C. Tras lavados con PBS la membrana se in-
cubó con el anticuerpo secundario unido a peroxidasa y la banda se
visualizó por el método de detección por quimioluminisencia (ECL).

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