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BEATRIZ CUBELOS Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

El extracto bacteriano que contenía la proteína His-GLYT1Ct
obtenido según lo indicado en el apartado anterior, se diluyó 1:1 en

solución de resuspensión y se incubó con una membrana de Inmo-

vilon que previamente había sido bloqueada. Tras una incubación de

una hora con el extracto proteico, la membrana se lavaba y pasaba

a ser incubada con un anticuerpo secundario dirigido contra la cola

de histidinas. Tras los oportunos lavados, la presencia de His-

GLYT1Ct se visualizó mediante un procedimiento de quimioluminis-
cencia (ECL). Las soluciones de bloqueo, resuspensión y lavado uti-

lizadas en el ensayo, fueron proporcionadas por el fabricante.

Cultivo y transfección de células COS-7

La línea celular COS-7 se cultivaban en DMEM suplementado
con suero de ternera fetal al 10% y se mantenían a 37º C y 7 % de
CO2. Las células se plaqueaban al 50% de confluencia un día antes
de ser transfectadas. La transfección se realizaba con Lipofectamina
Plus (Gibco, USA). Las células eran incubadas con los complejos de
lípidos y ADN en DMEM sin suero durante tres horas a 37º C y 7%
de CO2. Transcurrido este tiempo se añadía más medio de cultivo
y suero bovino fetal hasta el 10%. Las células se utilizaban a las
48 horas de la transfección.

Enyaso de inmunoprecipitación

Las células COS-7 transfectadas o los sinaptosomas de cerebro de
rata fueron solubilizadas en una solución de lisis (50 mM tris- HCl,
pH 7,5, 1% Triton X-100, 100 mM NaCl y 1 mM EDTA) durante
30 minutos a 4º C. Tras la centrifugación, el precipitado insoluble
fue eliminado y los sobrenadantes incubados con los anticuerpos
correspondientes durante dos horas, luego se adicionó 40 µl de una
suspensión de bolas unidas a proteína A (Sigma) y la mezcla se
incubó durante una hora a temperatura ambiente y con agitación
rotatoria. Las bolas fueron lavadas con PBS frío cinco veces. Final-
mente se añadieron 50 µl de tampón de carga Laemmli. Las mues-
tras se hirvieron durante cinco minutos para disociar la unión de las
proteínas a las bolas y posteriormente se sometieron a electroforesis
seguida inmunotransferencia como se ha describirá más adelante.

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