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VOL. 66, (3) 2000 APOPTOSIS EN ADIPOCITOS MARRONES

Ya que habíamos visto que la sobreexpresión del gen ras
transformado inducía apoptosis en adipocitos marrones transfectados
tanto permanente como transitoriamente, decidimos bloquear la vía
Ras/Raf-1/MEK1/MAP-quinasa para intentar rescatar estas células de la
muerte apoptótica. Para ello las células MB 1.3.19 se transfectaron
transitoriamente con construcciones dominantes negativas de Ras ('Ras)
y Raf-1 ('Raf), (pMEXneo-H-rasasn17 y pMNC-raftrp375) o con el vector
vacío (pMEXneo). Los resultados obtenidos tras la transfección de un
mutante dominante negativo de ras ('Ras) y de raf ('Raf) en las células
MB 1.3.19 dio lugar a una disminución de las células hipodiploides, de la
fragmentación del ADN.

El siguiente paso fue el bloqueo de la ruta Ras/Raf/MEK/MAP-
quinasa utilizando un inhibidor específico de la activación de MEK-1 por
Raf-1, el PD098059 (21). Las células MB 1.3.19 fueron incubadas
durante 6h en medio libre de suero tanto en ausencia como en presencia
de PD098059 30 PM, y posteriormente fueron recogidas para determinar
las células con contenido en ADN inferior a 2C, así como la existencia de
ADN fragmentado por electoforesis. La presencia de PD098059 aumentó
significativamente el porcentaje de células hipodiploides con respecto a
los adipocitos marrones cultivados simplemente en ausencia de suero. De
la misma manera, el tratamiento con el inhibidor dio lugar a un aumento
en la fragmentación del ADN, observada al realizar una electroforesis del
ADN extranuclear.

Los mecanismos moleculares que regulan la apoptosis no están
todavía demasiado claros, aunque se conocen varias proteínas, como los
miembros de la familia Bcl-2, que parecen estar implicadas en el control
de este proceso. Dentro de esta familia, hay proteínas con actividad anti-
apoptótica, y otras que actúan promoviendo la muerte celular.
Basándonos en trabajos anteriores en los que se había relacionado a las
proteínas Bcl-2 y Bcl-xL con Ras y Raf (22,23,24), decidimos estudiar la
posible interacción de estas proteínas en nuestro sistema. Nuestros
resultados demostraron que, en condiciones no apoptóticas (presencia de
suero o de 'Ras o 'Raf), en las células MB 1.3.19, la expresión de la
proteína anti-apoptótica Bcl-2 predominaba frente a la expresión de la
proteína pro-apoptótica Bcl-xS. Sin embargo, en condiciones apoptóticas

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