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completo de técnicas para ser utilizadas en relación con la solubi-
lización de membranas por detergentes. La liberación al medio
acuoso externo de compuestos fluorescentes hidrosolubles encap-
sulados en los liposomas se puede observar en tiempo real. El uso
de compuestos fluorescentes de diferentes pesos moleculares [30,
56] indica el tamaño de las discontinuidades en la bicapa. Ciertas
sondas fluorescentes bien conocidas, por ejemplo, el difenilhexa-
trieno, proporcionan información sobre el orden molecular de la
bicapa y su perturbación por los tensioactivos [57]. Además, el mo-
vimiento transbicapa, o flip-flop, de moléculas anfifílicas, incluidos
los tensioactivos, también se puede evaluar con técnicas de fluores-
cencia [56, 58].
En general, se recomienda una combinación de técnicas.
Por ejemplo, a pesar de sus deficiencias, la crio-TEM es una herra-
mienta muy útil en la investigación del mecanismo de solubiliza-
ción. La información cualitativa sobre los tipos de estructuras en las
mezclas de lípidos y detergentes es esencial para la correcta inter-
pretación de la dispersión de la luz y los datos de RMN. Esto es par-
ticularmente importante en los estudios mecanísticos, porque se
puede esperar que las estructuras de transición contribuyan muy
poco (si es que lo hacen) a las mediciones espectroscópicas. Sin em-
bargo, la mera existencia de una estructura transitoria proporciona
pistas sobre el mecanismo de solubilización, incluso cuando tales
estructuras rara vez se observan. Como ejemplo, la crio-TEM de las
estructuras presentes en dispersiones obtenidas por adición del de-
tergente no iónico octilglucósido a las vesículas de fosfolípidos re-
veló, antes de la formación de micelas mixtas cilíndricas, liposomas
con poros de tamaños cada vez mayores al agregar más octilglu-
cósido [59]. La última observación concuerda con los datos de fluo-
rescencia sobre la fuga de solutos encapsulados [56, 60, 61].
2.4. EL MODELO DE TRES ETAPAS: DEFINICIONES Y AM-
BIGÜEDADES
Se han propuesto varios mecanismos para la solubiliza-
ción de bicapas por detergentes. El consenso más general es que
puede describirse según un modelo de tres etapas o pasos, como lo
proponen Helenius y Simons [3]. El término "modelo de tres etapas"
en sí es bastante ambiguo. A menudo se entiende en términos ter-
modinámicos, lo que significa que, en el equilibrio, en el rango de
valores debajo de Resat (Etapa 1), los conjuntos mixtos son bicapas;
que por encima de Resol(Etapa 3), son micelas; y que dentro del
rango de valores entre Resat y Resol (Etapa 2), coexisten bicapas y mi- por Resat. El mecanismo detallado de esta transformación de bicapa
celas. Sin embargo, el modelo también a menudo se entiende en
términos cinéticos o mecanicistas, es decir, en términos de la se-
cuencia de procesos que ocurren cuando se agrega una concentra-
ción solubilizante de detergente a las bicapas lipídicas. En estos
Detergents: from physical principles to biopharmaceutical
62 applications (or why we fight covid-19 with toilet soap)
Félix M. Goñi y Alicia Alonso
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº1 (2021) · pp. 53 - 96
ANALES
RANF
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términos, la Etapa 1 se relaciona con interacciones entre detergentes
y lípidos que no producen estructuras micelares, la Etapa 2 es aqué-
lla en la que las bicapas saturadas de detergente se convierten en
micelas mixtas, y la Etapa 3 está reacionada con la reducción del
tamaño de las micelas mixtas como resultado de su interacción con
más d tergente. En términos de procesos, el modelo incluye una
serie de etapas:
Etapa 1. Partición del detergente entre las bicapas lipídicas y el
medio acuoso, descrita por un coeficiente de partición K, definido
como
K = Dt /(L + Db)Dw
Donde Dt es la concentración total de detergente, L es la concen-
tración de lípido y Db y Dw son las concentraciones de detergente
unida a la membrana y en el agua, respectivamente. Por lo tanto,
1/K = (1/Re)/(1/Dw)
Etapa 2. Una desintegración inducida por el cambio en la com-
posición de las bicapas, para formar micelas mixtas largas y filifor-
mes.
Etapa 3. A concentraciones de detergente aún más altas, la so-
lubilización es seguida por una serie relativamente rápida de pro-
cesos entrópicos, en los que se mezclan micelas grandes de
detergente-fosfolípido con micelas de detergente puro, y se obtie-
nen micelas mixtas más pequeñas con una mayor relación deter-
gente / fosfolípido.
La primera y tercera etapas en este esquema son aparen-
temente triviales. Se cree comúnmente que, para el detergente, el
reparto membrana/agua es rápido, pero la saturación de la bicapa
se puede ralentizar por la necesidad de una difusión (nuevo re-
parto) del detergente entre las monocapas externa e interna de la
bicapa (ver 2.7.a). El equilibrio de los sistemas mixtos de micelas
(en la Etapa 3) es mucho más rápido que el equilibrio de los siste-
mas m celares y lamelares. La etapa 2 corresponde al proceso de
disociación de micelas de una composición dada por Resol a partir
de las bicapas saturadas en detergente, de una composición dada
en micelas (micelización) no se comprende completamente y es el
tema de varias de nuestras investigaciones.
En la mayoría de los protocolos de solubilización común-
mente utilizados, la concentración de detergente es suficiente para
la solubilización de la membrana (en equilibrio), y el comienzo de
la micelización (Etapa 2) a menudo ocurre antes de que la Etapa 1
alcance el equilibrio. Esto, por supuesto, añade complejidad al pro-
ceso.