Page 63 - 87_01
P. 63
ANALES centración de detergente en estructuras mixtas de lípido-detergente
RANF y la concentración de fosfolípido en los puntos de inicio y finalización
de la solubilización. Estos dos parámetros son los Resat y Resol, antes
www.analesranf.com descritos.
de lípido las concentraciones críticas de detergente pueden no ser Además de la dispersión luminosa, existe toda una serie
función lineal de [L] [41]. Los diagramas de fases describen los es- de técnicas destinadas a estudiar la dinámica de la solubilización de
tados de equilibrio. En sistemas mixtos de lípidos y detergentes en liposomas y la formación de los autoensamblajes formados por mez-
soluciones acuosas, los límites de fase describen el rango de solubi- clas de detergente y lípido, incluyendo el tamaño, la forma y la com-
lización parcial, a saber, el rango de concentraciones de fosfolípidos posición de los liposomas y las micelas mixtas, preferiblemente sin
y detergentes donde la energía asociada a las micelas mixtas lípido- separar las formas solubilizadas de las no solubilizadas, pues las téc-
detergente es del mismo orden de magnitud que el de los liposomas nicas de separación llevan con frecuencia a la aparición de artefactos.
saturados con detergente [20]. En varias publicaciones se observó El método más directo para proporcionar información sobre la forma
que los límites de fase eran independientes del procedimiento uti- y el tamaño de los conjuntos detergente-lípido es la criomicroscopía
lizado para preparar el sistema mixto, asegurando que los diagra- electrónica de transmisión (crio-TEM) [44-46]. Sin embargo, la crio-
mas de fase describían la situación de equilibrio, por ejemplo, en TEM difícilmente puede arrojar resultados cuantitativos fiables sobre
Schnitzer y cols. [41]. Desgraciadamente, en muchas partículas pequeñas en presencia de partículas grandes. Esto último
publicaciones el procedimiento utilizado para estudiar los diagramas también es cierto para la dispersión de la luz, tanto estática como
de fase es tal que no se puede garantizar que todos los experimentos dinámica (correlación de fotones). En consecuencia, la espectroscopía
se hayan realizado en condiciones de equilibrio (por ejemplo, Kragh- de dispersión de la luz y otras técnicas de dispersión, aunque am-
Hansen y cols. [42], y Stuart y Boekema [43]). A pesar de esta defi- pliamente utilizadas por razones de comodidad, producen resultados
ciencia, consideramos que cada mezcla de estado estacionario está cuestionables en el inicio de la solubilización. También se debe tener
en equilibrio, pero somos conscientes de la posibilidad de que, para en cuenta que los métodos de dispersión de la luz pueden verse per-
ciertas composiciones, la estructura de los agregados lípido-deter- turbados por el aumento de la turbidez de algunos detergentes, por
gente pueda ser simplemente un reflejo de trampas cinéticas, como ejemplo el Triton X-100, que por encima de cierta temperatura
se describe a continuación. ("punto de nube") da lugar a formaciones altamente dispersantes
[47].
2.3. MÉTODOS PARA CARACTERIZAR LA SOLUBILIZACIÓN
DE MEMBRANAS POR DETERGENTES Por el contrario, la espectroscopía de resonancia magnética
nuclear de fósforo-31 (31P-RMN) es sensible a partículas pequeñas
En la mayoría de los estudios, las suspensiones de liposo- porque solo partículas pequeñas (por ejemplo, micelas mixtas) pro-
mas se mezclan con disoluciones de detergentes y los sistemas resul- ducen señales relativamente estrechas (observables) [48-50], mien-
tantes se analizan por métodos espectrofotométricos, más tras que el espectro de vesículas grandes se ensancha hasta hacerse
comúnmente la dispersión luminosa. El efecto inicial de la adición casi indetectable. Dadas las diferentes sensibilidades de la dispersión
de detergente sobre los liposomas depende del estado de agregación de la luz y la RMN, estos métodos son complementarios. La RMN se
de los lípidos y del tamaño de las vesículas. En concreto, la adición puede usar para determinar cuantitativamente la etapa inicial de
de detergente a vesículas unilamelares pequeñas (SUV) da como re- solubilización (por lo tanto, Resat), mientras que las técnicas de dis-
sultado una mayor dispersión luminosa debido al crecimiento del ta- persión de la luz pueden ser útiles para proporcionar datos de Resol.
maño de las vesículas inducido por el detergente. Sin embargo, para También se puede obtener mucha información sobre los procesos es-
vesículas unilamelares grandes (LUV), el tamaño de la vesícula puede tudiados utilizando la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) [51-
permanecer inalterado o modificarse ligeramente antes del inicio de 55]. Si se interpreta correctamente, este método puede proporcionar
la solubilización debido a una solubilización de transición y la pos- información tanto sobre la concentración de detergente a la cual ocu-
terior reconstitución. En general, a medida que se agregan cantidades rre una transformación como sobre el calor asociado a cada proceso.
crecientes de detergente a una suspensión de membranas, la disper- Las mediciones del ITC no proporcionan información estructural, pero
sión de la luz permanece constante o incluso aumenta hasta que, en la técnica es útil para obtener datos sobre procesos rápidos. Dados
un punto crítico, comienza a disminuir. Este es el inicio de la solubi- los problemas asociados a la sensibilidad de las técnicas de dispersión
lización (Fig. 6a, Dtsat). A medida que aumenta la conce tración de a partículas grandes, el ITC es beneficioso para estudiar procesos que
detergente, se alcanza otro punto crítico al finalizar la solubilización probablemente se vean afectados por tales artefactos.
(Dtsol), más allá del cual la dispersión de la luz no sigue disminu-
yendo. La dependencia (aparentemente lineal) de los últimos dos La espectroscopía de fluorescencia ofrece un conjunto
puntos críticos con respecto a la concentración de fosfolípidos (Fig.
6b) da lugar a un diagrama de fases sencillo. La pendiente de cada
una de estas líneas [detergente] / [lípido] es la relación entre la con-
Detergentes: de los principios físicos a las aplicaciones 61
biofarmacéuticas (o por qué prevenimos la covid-19 con agua y jabón)
Félix M. Goñi y Alicia Alonso
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº1 (2021) · pp. 53 - 96
