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la reacción de la polimerasa en la copia del ADN (ver el M.ª del Carmen Avendaño López
apartado 2.13), pero esta enzima actuaba a gran velocidad
añadiendo nucleótidos a la copia sin que se pudiesen terminal. Los diversos fragmentos se separan en función
determinar cuáles eran las bases que se iban añadiendo (- de su tamaño mediante electroforesis en gel de
A,C,C,C,T,G,C, etc.). En 1977, Sanger desarrolló un poliacrilamida (una técnica que permite separar
método para parar la reacción utilizando pequeñas fragmentos de ADN cuya longitud difiere en un sólo
cantidades de 2',3'-didesoxinucleótido trifosfatos (ddNTPs) nucleótido). A partir del gel se puede reconstruir la
(ver un ejemplo en la Figura 8). Éstos impiden la secuencia que se ha sintetizado, que es complementaria a
elongación de cadena catalizada por la ADN polimerasa la secuencia del molde (25). Mediante esta tecnología, se
porque, aunque pueden insertarse en una hebra de ADN, la puede determinar la secuencia de moléculas de ADN de
carencia del grupo 3’-hidroxilo no permite que se formen hasta 800 nucleótidos de longitud y fue utilizada por
enlaces fosfato con un nuevo 2’-desoxiribonucleósido primera vez por Sanger para resolver la secuencia
trifosfato. completa del bacteriófago FX174 en 1977 (26).
NH2 En 1976-1977, Allan Maxan y Walter Gilbert
desarrollaron un método diferente para secuenciar ADN
OOO NN basado en su modificación química y posteror escisión
donde se encuentren bases específicas (27). El método
HO P O P O P O ON N requiere el marcaje radioactivo en uno de los extremos y la
OH OH OH purificación del fragmento que se desea secuenciar. Tras
un adecuado tratamiento químico se obtienen fragmentos
ddATP 3' 2' de ADN de diferente longitud cuyas secuencias de
nucleótidos se identifican por electroforesis en gel. Para
Figura 8. Los ddATPs carecen del grupo hidroxilo en 3’ de visualizar los fragmentos generados en cada reacción se
los 2’-desoxiribonucleótidos. hace una autoradiografía que proporciona una imagen de
bandas oscuras correspondientes a los fragmentos
La reacción en cadena de la polimerasa con una marcados con el radioisótopo y, a partir de ellos, se puede
muestra de ADN en una mezcla que contenga un cebador, deducir la secuencia. Por ser bastante laborioso este
los cuatro 2’-desoxiribonucleótidos, y un 2’,3’- procedimiento se ha sustituido por métodos enzimáticos
didesoxiribonucleótido, producirá cadenas cuya longitud como el de Sanger que, además de ser más sencillos,
dependerá de donde se encuentre el nucleótido con una pueden llevarse a cabo de forma automatizada.
base complementaria a la del 2’,3’-didesoxiribonucleótido
utilizado, porque su incorporación finalizará la reacción en El año 1980, Sanger y Gilbert compartieron la mitad
cadena. La secuenciación se lleva a cabo en cuatro tubos, del Premio Nobel de Química "for their contributions
cada uno con un ddNTP distinto. Cuando la ADN concerning the determination of base sequences in nucleic
polimerasa incorpora aleatoriamente un ddNTP la reacción acids". Paul Berg recibió la otra mitad "for his
se detiene, de manera que se generan fragmentos de fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids,
distinta longitud, todos ellos con el mismo ddNTP with particular regard to recombinant-DNA" (ver el
apartado 2.11) (Figura 9).
Figura 9. Paul Berg, Walter Gilbert y Frederick Sanger.
2.9. ADN complementario o ADN copia (ADNc). los genes a los mensajes y nunca al revés”. Esta enzima
Transcriptasa inversa podía construir ADN a partir de una plantilla de ARN, por
lo que la llamaron transcriptasa inversa o
En 1970 los virólogos David Baltimore y Howard retrotranscriptasa. Pronto demostró su utilidad en el
Temin, trabajando de forma independiente, descubrieron proceso de clonación de genes. Las técnicas de
en los retrovirus una enzima que contradecía el dogma secuenciación de genes habían permitido descubrir que
central de Crick: “la información genética solo transita de
130 @Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
