Page 57 - 81_01

Paloma Santos-Moriano et al

Figura 6. Cromatograma de los FOS producidos por LEV soluble. Condiciones de reacción: 5 U/ml de LEV soluble y 600 g/l de sacarosa

en tampón acetato sódico 50 mM pH 5.6 A. HPAEC-PAD con columna CarboPack PA1 19 h de reacción. B. HPAEC-PAD con columna

CarboPack PA200 50 h de reacción. Línea gris: estándar de inulina. 1: glucosa; 2: fructosa; 3: sacarosa; 5: 1-kestosa; 6: blastosa; 8: 6-

kestosa; 10: neokestosa; 12: nistosa; 13: 66-nistosa.

(GFn y Fn). En la Figura 6B se puede observar cómo van

La producción de FOS por la enzima soluble alcanzó apareciendo picos de azúcares cada vez más largos tanto
su máximo cuando el 85% de la sacarosa se había de la serie de la inulina (1F-FOS) como otros sin identificar
consumido y la tasa de transfructosilación/hidrólisis era que probablemente pertenezcan la serie 6F-FOS. Sin
2.2. El FOS más abundante en la reacción era 6-kestosa
seguido de 1-kestosa y neokestosa (Figura 7 triángulos). embargo el levano de peso molecular mucho más elevado

no se pudo visualizar con este tipo de cromatografía.

Además el pico de blastosa era bastante importante en la 3.3. Entrecruzamiento de la levansacarasa con
reacción pero no disponíamos de cantidad suficiente para transglutaminasa
cuantificarlo.
Debido al reducido tamaño de LEV para su
Aparte de estos FOS se puede observar en los inmovilización por atrapamiento la enzima se entrecruzó
cromatogramas que la enzima es capaz de formar otros usando la enzima transglutaminasa. Se probaron diferentes
oligosacáridos de mayor grado de polimerización que no proporciones de ambas enzimas y LEV conservaba altos
se pueden identificar. Dado que uno de los productos niveles de actividad (medida por DNS) incluso tras la
descritos para la levansacarasa es el levano se intentaron adición de grandes cantidades de TG (resultados no
visualizar oligosacáridos cada vez más largos. Para ello se incluidos). Para analizar el tamaño de los agregados las
utilizó HPAEC-PAD con la columna CarboPack PA200. reacciones se estudiaron electroforéticamente. Aparecieron
las mismas bandas que en el carril de LEV pero además se
Como estándar para aproximar el grado de podía ver un conglomerado que no era capaz de penetrar
polimerización se utilizó inulina (Raftiline® Orafti) en el gel (Figura 5A flecha negra). Para comprobar si esa
(Figura 6B cromatograma gris) donde se puede observar banda era activa se estudió la actividad con un zimograma
toda la serie de la inulina desde GF2 hasta GF60. Las (Figura 5B carriles 2 3 y 4 flecha negra). La banda del
mismas muestras recogidas para el análisis de los FOS se agregado formado por entrecruzamiento era una vez más
analizaron con la nueva columna (Figura 6B). Al ser una incapaz de entrar en el gel pero se pudo detectar actividad.
columna más resolutiva además de los FOS identificados Sin embargo una cantidad importante de LEV quedaba sin
en el experimento anterior también se pudieron identificar entrecruzar incluso tras el tratamiento con 40 U/ml de TG.
la difructosa (F2) fructosilnistosa (GF4) y la neonistosa; También se pudo observar la precipitación de proteínas de
además de diversos productos de la serie de la inulina

56 @Real Academia Nacional de Farmacia. Spain