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¿Un
paso
adelante
hacia
la
clonación
humana
con
fines
terapéuticos?

embargo
los
embriones
SCNT
generados
por
la
fusión
HVJ-­-E
no

sobrepasaban
la
fase
de
mórula
a
pesar
de
habérsele
aplicado
la

técnica
estándar
de
activación
con
ionomicina/DMAP
(activación

I/DMAP).

b. Para
mejorar
la
técnica
se
expusieron
a
un
electropulso

(electroporación)
embriones
SCNT
fusionados
con
HVJ-­-E
antes
de
la

activación
I/DMAP,
obteniéndose
un
10%
de
embriones
SCNT
que

alcanzaban
la
fase
de
blastocisto.

c. Utilización
de
inhibidores
de
la
histona
desacetilasa,
como
la

tricostatina
A
(TSA),
a
bajas
concentraciones
(10
nM)
y
corto
tiempo

de
exposición
(12
h).

2. Optimización
de
la
metodología
para
producir
embriones
humanos

SCNT
y
líneas
NT-­-ESC:

a. Utilizan
63
ovocitos
humanos
obtenidos
por
estimulación
ovárica
y

aspiración
folicular
transvaginal.

b. Obtención
de
fibroblastos
dermales
de
fetos
femeninos

sincronizados
en
fase
G0/G1
como
donadores
de
núcleos.

c. Eliminación
del
huso
del
ovocito
MII
y
fusión
con
la
célula
somática

donadora
con
la
técnica
HVJ-­-E
dentro
de
los
60
minutos
desde
la

obtención
del
ovocito.

d. El
95%
(60
de
63)
de
los
ovocitos
sobreviven
a
la
eliminación
del

huso
MII.

e. La
introducción
de
los
núcleos
procedentes
de
los
fibroblastos

donadores
fusionados
con
la
técnica
HVJ-­-E
se
realizó
al
100%.

f. Los
ovocitos
fueron
activados
con
electroporación/DMAP
(4
h)
y

expuestos
a
TSA
(10nM
durante
12
horas).

g. De
63
ovocitos
iniciales,
sobrevivieron
60
(95,2
%)
de
los
que
52

(86,7
%)
comienzan
a
dividirse,
llegando
32
(61,5
%)
de
ellos
a
la

fase
de
8
células,
7
(13,5
%)
hasta
la
fase
de
mórula
y
6
(11,5
%)

hasta
blastocisto
SCNT,
de
los
que
solamente
uno
sobrevivió
a
la
fase

de
cultivo
sobre
capa
nutritiva
pero
que
no
dio
lugar
a
ninguna
línea

celular
NT-­-ESC.

3. Modificación
definitiva
de
la
técnica:

a. Dado
que
la
eliminación
del
huso
en
ovocitos
MII
produce
una

activación
prematura,
se
asume
que
factores
específicos
de
la

meiosis
se
retienen
durante
la
eliminación
del
huso
pero
decaen
en

su
actividad
debido
a
la
activación
espontánea.
Por
tanto,
se
decide

utilizar
tratamientos
no
invasivos
para
mantener
la
parada
meiótica

durante
la
manipulación,
decidiéndose
por
la
cafeína
(inhibidora
de

proteinfosfatasa)
que,
en
2007,
Mitalipov
y
colaboradores
habían

demostrado
ser
eficaz
en
ovocitos
de
macaco
al
impedir
la
activación

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