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VOL. 76 (4), 435-457, 2010 CARACTERIZACIÓN FARMACOLÓGICA Y ANÁLISIS FUNCIONAL…
Las soluciones de registro variaron dependiendo del tipo de ex-
perimento. Así, la solución interna empleada en los experimentos
de caracterización farmacológica de los nAChRs tuvo la siguiente
composición (mM): glutamato de Cs+ 145, NaCl 8, HEPES 10, EGTA
10, MgCl2 1, ATP.Na2 2, GTP.Li2 0,3 (pH ajustado a 7,2 con CsOH);
en los experimentos en los que se llevaron a cabo registros del po-
tencial de membrana, las micropipetas fueron rellenadas con la si-
guiente solución (mM): glutamato de K+ 145, KCl 10, HEPES 10,
MgCl2 2, EGTA 0,1, ATP.Na2 2 y GTP 0,3, (pH ajustado a 7,2 con
KOH). En todos los casos la solución externa con la que se super-
fundieron las células durante los experimentos (2 mL.min-1, a tem-
peratura ambiente) estuvo compuesta por (mM): NaCl 145, KCl 2,8,
CaCl2 1, MgCl2 1, HEPES 10, glucosa 10 (pH ajustado a 7,4 con HCl
o NaOH).
La administración de fármacos se realizó directamente sobre la cé-
lula en estudio mediante un sistema de perfusión por gravedad (Fi-
gura 2A) que constaba de cinco vías dotadas de electroválvulas con-
troladas con el programa PULSE 9.7. La salida del sistema se colocó
aproximadamente a 100 µm de la célula de forma que el recambio de
la solución que rodea a la célula se produjera en ~30 ms (Figura 2B).
La estimulación con los fármacos agonistas se realizó mediante
pulsos breves (100 – 1000 ms) administrados tres veces consecutivas
a intervalos de 45 s, calculándose posteriormente la media de las res-
puestas (pulsos 1º, 2º y 3º). El efecto de los fármacos antagonistas se
evaluó también por triplicado en cada experimento, perfundiéndose
en el baño durante 45 s antes de ser coaplicados localmente con el
agonista (pulsos 4º, 5º y 6º). Finalmente, el agonista fue administra-
do tres veces más durante el período de lavado del antagonista con
objeto de estudiar la reversibilidad del efecto de este último (pulsos
7º, 8º y 9º) (Figura 2C).
En la elaboración de curvas concentración-respuesta, las corrien-
tes obtenidas en presencia de las diferentes concentraciones de an-
tagonista fueron normalizadas respecto a la corriente control regis-
trada en ausencia del mismo. Tanto las representaciones de barras
como el ajuste de las curvas concentración-respuesta se llevó a cabo
con el programa GraphPad Prism V. 4.03 (GraphPad Software Inc.,
EEUU).
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