Page 164 - 71_02

CRISTINA HERVÁS Y COLS. AN. R. ACAD. NAC. FARM.

agonista. Es de destacar que no todas las células responden y que
además la distribución en la topografía neuronal es muy restringida,
siendo especialmente marcada en el soma y mas escasa en las pro-
longaciones axo-dendriticas de las neuronas en cultivo. Sin duda
esta distribución tiene un significado funcional y circunscribe la
acción de los receptores a lugares definidos de la célula. En la figura
1E se puede observar la gran abundancia de CaMKII, ya que el
anticuerpo reconoce el enzima fosforilado y sin fosforilar. Tanto el
soma como las prolongaciones axo-dendriticas contienen gran can-
tidad del enzima, pero según cual sea la distribución de los recep-
tores que movilizan calcio, se activará la CaMKII que esté localizada
en la proximidad. En la figura 1F se representa mediante barras la
incidencia relativa en la activación de la CaMKII del soma y de las
fibras en respuesta al UDP.

La presencia de la CaMKII en su forma fosforilada después de
estimular con UDP, sugiere la presencia de receptores P2Y6 funcio-
nales. Para confirmarlo, se han realizado estudios de PCR en cé-
lulas granulares en cultivo, con la pareja de oligonucleótidos en
sentido de avance y en sentido reverso; secuencia CGTGAGGATTT-
CAAGCGACTG (forward primer) y secuencia CCAAACGACTCCACA-
TACCA (reverse primer). El fragmento se corresponde en PCR con
un tamaño de 371 pares de bases. La expresión se compara a los
7 y 14 días en cultivo, y también con astrocitos en la figura 2A.
En la figura 2B pueden observarse mediante estudios de microfluo-
rimetría realizados en célula individual la gran variedad de respues-
tas a nucleótidos. La técnica de microfluorimetría ha sido puesta
a punto en nuestro laboratorio para estudios en células y termina-
les nerviosos individuales (Díaz-Hernández y col., 2001). En este
caso las neuronas granulares se incuban con el marcador fluores-
cente para calcio Fura-2AM (Molecular Probes). Una vez cargadas
las células, se lavan y se sitúan en una cámara de perfusión, bajo
el microscopio de fluorescencia, dónde son sometidas a la acción
de diversos compuestos de modo secuencial. La emisión de fluo-
rescencia a 510 nm, cuando son estimuladas a una longitud de
onda de 340 nm y de 380 nm es recogida en una cámara de video-
imagen. El cociente de la emisión a cada longitud de onda 340/380,
se transforma en concentración de calcio, mediante la ecuación de
Grynkievicz realizando una calibración con un patrón de calcio de

444