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VOL. 71 (2), 439-449, 2005 ACTIVACIÓN DE CaMKII POR UDP

mente y es uno de los enzimas clave en la plasticidad neuronal
requerida para el aprendizaje y la memoria (Bayer y Schulman,
2001).

Debido a la existencia de un elevado número de receptores para
nucleótidos, en este trabajo nos hemos centrado en el receptor P2Y6
y trataremos de demostrar que está presente en neuronas granula-
res, que es funcional y que su activación produce un incremento de
calcio en el citosol celular, lo que lleva emparejada la activación de
la CaMKII.

Los cultivos de células granulares han sido descritos en trabajos
previos del grupo (Hervás y col., 2003). En la figura 1 se puede
observar un cultivo típico. La inmunohistoquímica con anticuerpos
contra el marcador de vesículas neurales, sinaptofisina (anticuerpos
de la casa comercial Sigma), confirma la naturaleza neural de las
células y la ausencia de células contaminantes (figura 1 A). La inmu-
nohistoquímica positiva con respecto al marcador de vesículas glu-
tamatérgicas, el VGLUT-1 (de la casa comercial Synaptic systems),
nos confirma la naturaleza de neuronas glutamatérgicas, que son las
granulares de cerebelo (figura 1 B). En las figuras 1C y 1D podemos
observar el inmunomarcaje con el anticuerpo para la forma fosfori-
lada de la CaMKII (anticuerpos contra el epítopo de rata realizados
en conejo, de la casa comercial Upstate). En 1C se muestra el control
sin estimular con el agonista, el nucleótido de uridina UDP (Sigma).
En 1D se muestran las células granulares después de activar con el

FIGURA 1. Las neuronas granulares de 14 DIV se fijaron con una solución de para-
formaldehído al 4% tras lo cual se incubaron con anticuerpos específicos. (A) Inmu-
nodetección de la sinaptofisina (Sigma) 1:200 utilizando un anticuerpo secundario
acoplado a FITC (Sigma) 1:500. (B) La identificación del transportador vesicular de
glutamato VGLUT1 con el anticuerpo anti-VGLUT1 (Synaptic Systems) 1:1000 se
reveló con TRICT (Sigma) 1:500. Las neuronas se estimularon con un medio control
(C) y con UDP 100 µM (D) durante 5 minutos y se fijaron para obtener el inmuno-
marcaje con el anticuerpo para la Calmodulina quinasa II fosforilada (Upstate) 1:100.
El marcaje de la CaMKII total (Zymed) 1:100 se muestra en (E). La barra de escala
corresponde a 5 mm. (F) Las barras muestran los porcentajes de incremento ± SEM
en la intensidad de fluorescencia sobre el control sin tratar ejercido por el UDP y
medido en cuerpos celulares y fibras. Para cuantificar la fluorescencia se promedió,
utilizando el programa Lucida Analysis, los niveles de grises correspondientes a regio-
nes tomadas sobre los somas y las fibras por separado. N=3 cultivos distintos; 6-8

imágenes por tratamiento y cultivo.

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