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VOL. 70 (1), 95-123, 2004 GENOTOXICIDAD DEL ESTIRENO

naturaleza oleosa del SO y su consecuente baja solubilidad en medio
acuoso, se ha empleado como solvente para la preparación de las
soluciones de tratamiento dimetilsulfóxido (DMSO), utilizando este
mismo al 1% como control negativo.

2. ENSAYO DE MICRONÚCLEOS

Los cultivos se establecieron por duplicado añadiendo 0.5ml de
sangre a 4.5ml de medio de cultivo, se mantuvieron a 37ºC y a las
24h se les añadió la solución de tratamiento correspondiente (DMSO,
50 µM o 200 µM). El ensayo se realizó como describen Laffon et al.
(2001a). La tinción de los portaobjetos fue realizada con el colorante
fluorescente 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 5 µg/ml. Todos los
portaobjetos fueron codificados antes del análisis para evitar sesgos
en los resultados provocados por la posible subjetividad del observa-
dor. Se contaron un total de 1000 células binucleadas por tratamien-
to y donante (500 de cada réplica), cuantificando el número de MN
presentes en cada una de ellas.

3. ENSAYO DEL COMETA

El ensayo del cometa se ha desarrollado con 27 individuos, debi-
do a que de 3 de los donantes utilizados no se obtuvo suficiente
sangre heparinizada para llevar a cabo la extracción de leucocitos.
El aislamiento de leucocitos mononucleares procedentes de sangre
heparinizada se ha realizado mediante centrifugación en un gradien-
te de densidad de Ficoll. El ensayo del cometa se ha llevado a cabo
siguiendo lo descrito en Laffon et al. (2001a). Todos los portaobjetos
fueron codificados y teñidos con 60 µl de DAPI 5 µg/ml. La captura
de las imágenes fue realizada mediante el programa Leica QWIN
(Leica Imaging Systems), evaluando como parámetro cuantitati-
vo longitud de la cola del cometa (TL), medida desde el centro es-
timado del núcleo (Olive et al., 1992). Se analizaron un total de
100 células por tratamiento y donante, 50 procedentes de cada una
de las réplicas.

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