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VOL. 68 (3), ANAL. REAL ACAD. NAC. FARM

nuación a que nivel de la ruta de señalización por la que la insulina ejerce
dichos efectos estaba actuando la ceramida. Por ello determinamos en
primer lugar la actividad de la PI3-quinasa tras estimulación con insulina
en células pretratadas con ceramida. La ceramida no modificó la estimu-
lación por insulina de PI3-quinasa, tanto la asociada a IRS-1 como a IRS-
2 indicando que la ceramida no interfiere con la insulina a este nivel. Por
debajo de PI3-quinasa, la siguiente diana estudiada fue Akt. Akt/PKB se
fosforila fuertemente en el residuo Ser473 y algo menos en Thr308 tras
estimulación con insulina. Ambas fosforilaciones son necesarias para la
activación de dicha enzima. Sin embargo, tras el pretratamiento de las
células con C2-ceramida la insulina no fue capaz de fosforilar ni activar
Akt, mientras que el análogo inactivo C2-dihidroceramida no produjo
ningún efecto negativo. Puesto que los adipocitos marrones expresan la
proteína PKCzeta que también ha sido relacionada con el transporte de
glucosa estimulado por insulina, analizamos si las ceramidas estaban
afectando su actividad enzimática. Sin embargo, C2-ceramida no sólo no
inhibió la activación de PKCzeta por insulina sino que la estimuló per se,
siendo el efecto aditivo en presencia de los dos tratamientos. Ya se había
descrito anteriormente que la ceramida por sí sola estimulaba la actividad
PKCzeta [30]. Por ello estos resultados excluyen a la PKCzeta como
diana de la ceramida para producir resistencia a la acción de la insulina.

El tratamiento con ceramida inhibió la actividad Akt/PKB, pero
no la actividad PI3-quinasa ni PKCzeta, por lo que decidimos investigar
los mecanismos de esa inhibición. Nos planteamos dos posibles meca-
nismos para explicar los efectos de la ceramida: La ceramida podría estar
inhibiendo la actividad PDK1 y PDK2 necesarias para la fosforilación y
posterior activación de Akt/PKB y/o, podría estar activando una fosfatasa
que defosforilase Akt/PKB y por lo tanto estuviese inhibida la actividad
de Akt/PKB. El primer posible mecanismo fue descartado tras analizar la
actividad de Akt/PKB en células transfectadas con un plásmido de expre-
sión para una forma permanentemente activa de Akt/PKB (pSG5-PKBgag,
GagAkt) y comprobar que la actividad Akt/PKB presente en las células
control transfectadas estaba inhibida tras el tratamiento con ceramida. La
segunda hipótesis fue estudiada impidiendo la defosforilación de
Akt/PKB con un inhibidor de serina/treonina fosfatasas, el ácido okadai-

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