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tergentes en estudio se clasificaban en una de dos categorías, a saber,
detergentes de solubilización rápida y de solubilización lenta. Esta
categorización era independiente de la concentración de detergente,
es decir, un tensioactivo "lento" no se podía convertir en un tensioac-
tivo "rápido" aumentando su concentración. Los espectros de 31P-
NMR indicaron que los detergentes de acción lenta causaban una
micelización gradual y monótona de las bicapas (dodecilsulfato de
sodio) o la formación de intermediarios no micelares más complejos,
quizás no lamelares (dodecilmaltósido). Por el contrario, los deter-
gentes rápidos (por ejemplo, Triton X-100) provocaban la lisis y el
reensamblaje de las vesículas antes de que tuviera lugar la solubi-
lización en masa. Estos resultados apoyan la idea de que la solubi-
lización de la membrana por los detergentes es rápida solo cuando
el movimiento transbicapa (volteo) del surfactante es fácil.
4.4.d. Membranas resistentes a los detergentes
Desde los primeros estudios de solubilización de biomem-
branas por detergentes [116] quedó claro que, en casi todos los casos,
había una fracción de componentes de membrana que no se lograba
solubilizar por completo. Este residuo se llamó “membranas resis-
tentes a los detergentes”, DRM por sus siglas en inglés. Ya hemos co-
mentado (sección 3) la confusión que se creó en la década 1997-2006
cuando algunos autores asimilaron las DRM con las balsas lipídicas
o rafts. En este apartado describiremos sucintamente nuestros es-
fuerzos por clarificar la situación, mediante el estudio de membranas
modelo en equilibrio con detergente. Una vez más, el Triton X-100
fue el surfactante más utilizado en este contexto.
La hipótesis de los rafts [110] tuvo, entre otras virtudes, la
de hacernos pensar en la posibilidad de dominios de membrana con
propiedades distintas de las de la fase líquida- desordenada, por
ejemplo microdominios en fase gel, o en fase líquido-ordenada. Por
ese motivo comenzamos una larga serie de estudios examinando,
en primer lugar, la solubilización de bicapas en fase gel, lo que hasta
entonces apenas se había estudiado. Patra y cols. [102], midiendo
la solubilización de las bicapas de fosfatidilcolinas saturadas por Tri- binaria de esfingomielina de huevo / ceramida de huevo (SM / Cer)
ton X-100, pudieron observar que en el estado de gel, mucho más
que en el estado fluido, la cantidad de detergente requerida para
solubilizar el fosfolípido dependía en gran medida de la longitud de
la cadena. Las PC con ácidos grasos saturados de 16 y 18 carbonos
eran prácticamente insolubles a 4 ºC. Sin embargo, la adición de re-
activos solubles en agua que perturban el enlace de hidrógeno, por
ejemplo, urea, o de pequeñas proporciones de lípidos con escasa ten-
dencia a formar fases lamelares, hacía que las bicapas fueran sus-
ceptibles de solubilización por detergente, incluso a bajas
temperaturas.
Un descubrimiento importante en el terreno de las DRM
fue la constatación de que las bicapas que contenían esfingomielina
Detergents: from physical principles to biopharmaceutical
86 applications (or why we fight covid-19 with toilet soap)
Félix M. Goñi y Alicia Alonso
An. Real Acad. Farm. Vol. 87. Nº1 (2021) · pp. 53 - 96
ANALES
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u otros esfingolípidos complejos eran más fácilmente solubilizables
que las basadas en PC. Patra y cols [103] estudiaron experimental-
mente la solubilización por Triton X-100 de vesículas unilamelares
grandes formadas por esfingomielina de huevo pura o mezclas de
esfingomielina:colesterol a diversas temperaturas. Para la esfingo-
mielina pura, la solubilización ocurría más fácilmente a tempera-
turas justo por debajo de la temperatura de transición gel-fluido
Tm. En general, la esfingomielina de huevo se solubilizaba con Tri-
ton X-100 más fácilmente que la fosfatidilcolina de huevo. Las mez-
clas de esfingomielina y colesterol eran insolubles en detergente en
la mayoría de las condiciones. Se aplicó espectroscopia infrarroja
para explorar las interacciones del colesterol y la esfingomielina a
nivel de la interfaz lípido-agua. Además, se utilizaron varios aná-
logos de colesterol (colestano, colestanona, androstenol) en expe-
rimentos de solubilización en paralelo con observaciones de IR.
Los resultados mostraron que el colesterol modificaba la con-
formación (o las propiedades del enlace de H, o ambas cosas) del
grupo de cabeza polar de la esfingomielina, tanto por encima como
por debajo de Tm. Además, tanto el grupo hidroxilo en C3 como la
cadena de hidrocarburos en C17 del núcleo esteroide parecen ser
necesarios para que se detecte la insolubilidad. Estos resultados es-
tarían relacionados con la insolubilidad observada de las 'balsas'
de la membrana celular en detergente a 4 ºC, y en general con el
origen de las DRM.
Otro dato importante resultó ser el de la insolubilidad de
las bicapas formadas por esfingomielina y ceramida [151]. En este
trabajo, Sot y cols., para responder a algunas de las preguntas re-
levantes, comenzaron por buscar una composición de bicapa sencilla
que imitara a las membranas resistentes a los detergentes. El cri-
bado de múltiples composiciones lipídicas demostró que la mezcla
presentaba la resistencia a los detergentes requerida. En membra-
nas sin detergente compuestas por diferentes mezclas de SM y Cer
(5-30 % en moles de Cer), la calorimetría de barrido diferencial,
la espectroscopía de fluorescencia y los experimentos de microscopía
de fluorescencia revelaron la presencia de dominios discretos de gel
enriquecidos en Cer en un amplio rango de temperaturas. En par-
ticular, a temperaturas por debajo de la transición de fase de SM
(aproximadamente 40 ºC), usando microscopía de fluorescencia, se
observaban directamente dos fases gel (respectivamente enrique-
cidas en Cer y en SM). Aunque las membranas SM puras se solubi-
lizaban completamente con Triton X-100 a temperatura ambiente,
un 5% mol/mol de Cer era suficiente para inducir la resistencia al
detergente, incluso con un gran exceso de detergente y tiempos de
tratamiento prolongados. Las Cer de cadena corta no daban lugar
a resistencia a los detergentes. Las mezclas de SM / Cer que conte-
nían hasta 30 moles % de Cer se volvían completamente solubles