Page 58 - 84_01
P. 58
Telomere function and sirtuins 1 and 6 in colorectal cancer from obese and non-obese patients. Clinical correlations
Tabla 5. Mezcla de reacción para determinación de la longitud telomérica por qRT-PCR.
COMPONENTES VOLUMEN (µl) POR POCILLO
SYBR Green® Master Mix (2X) 5
Primer TEL reverse (10µM) 0,9
Primer TEL forward (10mM) 0,3
Primer RPLPO reverse (10mM) 0,5
Primer RPLPO forward (10mM) 0,3
AUE (Agua Ultrapura Estéril) (TEL/RPLPO) 1,8/2,2
TOTAL 8
Tabla 6. Secuencia de los primers de TEL y RPLPO.
Primer TEL reverse 5’-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGT-3’
Primer TEL forward 5’-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA-3’
Primer RPLPO reverse 5’-CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’
Primer RPLPO forward 5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’
Para cada pareja de primers se construyó una curva relativa de cada muestra con respecto al DNA de
estándar a través de diluciones seriadas del DNA de HeLa referencia se realizó siguiendo la fórmula descrita por
que permitieron calcular la eficiencia (E) de la prueba. Una Pfaffl (15):
vez obtenida la E, el cálculo de la longitud telomérica
E = 10^(-1/pendiente)
Ratio T/S = ?? ????? ????????????^?^(?(????? ??? ?????????? ??? ?????????????????????????????????????-?-?????? ??? ?????????? ?? ???????????????????????????)
2.2.b. Determinación de la actividad telomerasa y dicho producto es detectado con un anticuerpo anti-
La detección de la actividad telomerasa se realizó digoxigenina conjugado con peroxidasa que, al reaccionar
con la tetrametilbenzidina, su sustrato, genera un producto
empleando el kit comercial TeloTAGGG Telomerase PCR de color azul cuya absorbancia es proporcional a la
ELISA® (Roche), que se basan en una ampliación del cantidad de DNA telomérico añadido por la telomerasa.
método descrito por Kim et al. (16). La técnica se realiza Finalmente se añade ácido sulfúrico para detener la
en dos pasos, donde en el primero la enzima telomerasa reacción, lo que provoca el viraje a color amarillo.
añade repeticiones teloméricas (TTAGGG) al extremo 3’
del cebador sintético biotinilado P1-TS, que serán Utilizando el programa bioinformático Microplate
amplificados por PCR usando los cebadores P1-TS y P2, manager® (Bio-Rad) se mide la absorbancia de cada
generando así secuencias que difieren de tamaño en 6pb. pocillo a 450nm empleando una longitud de onda de
referencia de 690nm, donde aquellas muestras en las que la
En un segundo paso, los fragmentos amplificados por diferencia de absorbancias es superior a 0,2 se consideran
PCR son desnaturalizados e hibridados con una sonda “telomerasa positivas”.
específica marcada con digoxigenina (P3), con una
secuencia complementaria a la de las repeticiones 2.3 Ensayos de expresión génica de SIRT1 y SIRT6 por
teloméricas. El producto obtenido se inmoviliza en los qRT-PCR
pocillos recubiertos de estreptavidina de una placa de
ELISA gracias a que el cebador está marcado con biotina, Previamente se realizó la extracción y purificación de
los RNAs procedentes de los cortes de tejido (tumorales,
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
57
