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Sergio García Martínez et al.
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Tabla 4. Características clínicas de los pacientes del grupo 3.
GRUPO 3: PACIENTES OBESOS SIN CCR
Variable N
IMC
Sexo 60
Femenino 44
Masculino 16
18,5-24,9 60
25-29,9 0
0
>30 60
2.2. Análisis de la función telomérica media en Kb y en referencia a un patrón de peso molecular
estándar fue definido como:
La función telomérica fue evaluada en las muestras
objeto de estudio mediante la determinación de la longitud !!"#
de las secuencias teloméricas y de la actividad telomerasa. Longitud telomérica media (Kb) = !(!"#/!")
2.2.a. Determinación de la longitud telomérica ODi = señal quimioluminiscente
Li = longitud del TRF de la posición (i)
La extracción de DNA genómico se realizó siguiendo i = posición a lo largo de la calle de la muestra
el protocolo de Blin y Stafford (14) adaptado. La
cuantificación de la longitud telomérica (LT) para El grado de acortamiento telomérico en el tumor
muestras de tejido tumoral se realizó mediante el análisis respecto al control (ratio T/N) se determinó mediante el
de los Fragmentos de Restricción (TRF) y mediante PCR cociente TRF tumor/TRF control.
cuantitativa (qRT-PCR), mientras que para las muestras de 2.2.a.ii. Análisis por qRT-PCR
tejido adiposo únicamente se llevó a cabo mediante qRT-
PCR. Esta técnica se basa en la teoría de que la longitud
telomérica relativa de una muestra (ratio T/S) viene dada
2.2.a.i. Análisis por Telomere Restriction Fragment (TRF) por el número de copias de su secuencia telomérica (T)
dividida entre el número de copias de un gen de copia
En esta técnica se utilizó el kit Telo TAAGGG única (S), respecto al de un DNA de referencia. En este
Telomere Lenght Assay (Roche). El DNA genómico caso, el gen de copia única utilizado fue RPLPO y como
obtenido se digirió con enzimas de restricción HinfI y RsaI DNA de referencia se empleó el de la línea celular HeLa.
(degradan todo el DNA genómico excepto las regiones
teloméricas y subteloméricas), los fragmentos se separaron Se realizaron dos reacciones de amplificación por
mediante electroforesis y se transfirieron a una membrana muestra, cada una de ellas por triplicado, donde cada
de nailon mediante Southern blotting. Después, el DNA pocillo contenía 10ng DNA/µl y los reactivos indicados en
transferido se hibridó con una sonda marcada con la Tabla 5. En el caso de la reacción de amplificación de
digoxigenina (de unión específica a las regiones la secuencia telomérica, se emplearon los primers
teloméricas) y se incubó con el anticuerpo anti- correspondientes a telómeros (TEL) y para la
digoxigenina (unido covalentemente a la enzima fosfatasa amplificación del gen RPLPO los primers
alcalina), para posteriormente incubarlo con el sustrato correspondientes a dicho gen (RPLPO), todos detallados
CDP-Star, que genera una señal quimioluminiscente que en la Tabla 6:
permite visualizar los distintos fragmentos teloméricos en
un film de revelado.
Para analizar los resultados se utilizó el software Image
Gauge 3.46, donde el valor de la longitud telomérica
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