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Sergio García Martínez et al.
no tumorales y adiposo), mediante el método de la mezcla indicada en la Tabla 7 y las condiciones
Chomczynski y Sacchi (17) mejorado, utilizando TRIzol® proporcionadas por la casa comercial. Para comprobar que
(Invitrogen). Seguidamente se sintetizaron los cDNA la reacción se había producido correctamente, se realizó
(DNA complementario) empleando el kit Hight-Capacity una PCR de comprobación utilizando cebadores exón-exón
cDNA Reverse Transcriptions® (Applied Biosystem) con para el gen GAPDH.
Tabla 7. Ensayos de expresión de SIRT1 y SIRT6; mezcla de reacción para la transcripción reversa.
COMPONENTES VOLUMEN (µl) POR REACCIÓN
Tampón 10X de transcripción reversa 10
Mezcla dNTPs 25X 4
Mezcla Random Primers 10X 10
Enzima Transcriptasa Reversa (50U/µl) 5
Inhibidor de RNasa 2,5
AUE (Agua Ultrapura Estéril) 18,5
RNA 2µ en 50µl
TOTAL 100
Para realizar la PCR cuantitativa a tiempo real (qRT- previamente detallada se cargó por triplicado, y como
control negativo se utilizó AUE (Agua Ultra Estéril) en
PCR) se utilizó la mezcla de reactivos detallada en la lugar de cDNA. Para las muestras de tejido tumoral, el
Tabla 8. El reactivo TaqMan® Gene Expression Assay control está integrado por un pool de tejidos no tumorales,
20X (Applied Biosystems) incluye dos cebadores para mientras que para el tejido adiposo se cuenta con dos
amplificar la secuencia deseada y la sonda TaqMan MGB controles: cDNAs de pacientes obesos sin CCR (control de
(6-FAM dye-labeled)® para detectarla (Hs00966002_m1 pacientes obesos con CCR) y de pacientes no obesos con
para SIRT1, Hs01009005_m1 para SIRT6 y CCR (control de pacientes obesos con CCR).
Hs99999905_m1 para GAPDH). La mezcla de reacción
Tabla 8. Ensayos de expresión de SIRT1 y SIRT6; mezcla de reacción para qRT-PCR.
COMPONENTES VOLUMEN (µl) POR REACCIÓN
TaqMan® Gene Expression Assay 20X 10
TaqMan® Universal PCR Master Mix 2X 1
AUE (Agua Ultra Estéril) 8
cDNA (20ng/µl) 1
TOTAL 20
El análisis de la qPCR se basó en el método expresión relativa (RQ) del gen diana en cada muestra
comparativo de Ct (Cycle threshold). Para las muestras de respecto al control mediante la fórmula RQ = 2^ (- ??Ct).
tejido tumoral de colon, una vez obtenidas las medias de Para las muestras de tejido adiposo, el valor ?Ct se
obtiene de la misma manera pero el valor de ??Ct se
los valores de Ct de la muestra tumoral (Ct gen diana obtiene al restar al ?Ct de la muestra la media de ?Ct del
pool de muestras de tejido adiposo subcutáneo (SC) u
tumor) y del control (Ct gen diana control, formado por un omental (O) del grupo control correspondiente.
pool no tumoral), se normalizaron respecto al valor de Ct
del gen GAPDH (Ct endógeno) para obtener ?Ct. Al valor
?Ct de cada muestra tumoral se le resta el ?Ct del control
para obtener el valor de ??Ct. Finalmente, se calculó la
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