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La viabilidad de las MSCs en el sellador de fibrina se
midió en términos de actividad metabólica a través de un
ensayo CCK-8 siguiendo las instrucciones del fabricante
(Sigma, St. Louis, MO, USA). Brevemente, las MSCs se
combinaron con el sellador de fibrina y se mantuvieron en
cultivo durante dos días en DMEM. Como control
negativo, se utilizaron MSCs en condiciones de cultivo
estándar. Además, la morfología celular de las MSCs en
combinación con el sellador de fibrina se examinó
mediante microscopía óptica.
Para la combinación del sellador de fibrina con exo-
MSCs, los concentrados de exosomas se descongelaron
lentamente antes de combinarse con la solución de fibrina.
Un total de 200 µl de exosomas (medidos en proteína
total) a 20 000 µg/ml se mezclaron con trombina (500
IU/ml) a un ratio 1:1 y esta solución se mezcló con
fibrinógeno (80 mg/ml) a un ratio 1:1. Por último, ambas
diluciones se mezclaron usando un aplicador de doble
jeringa. Para la fijación de cada malla se usó un volumen
de 400 µl de la solución final (4 000 µg de proteínas
exosomales).
2.7. Modelo de hernia incisional y procedimientos
quirúrgicos
Los cuidados de los animales y todos los
procedimientos experimentales fueron aprobados por el
Comité de Ética y Experimentación Animal del Centro de
Cirugía de Mínima Invasión, y se desarrollaron de acuerdo
a las recomendaciones del gobierno local. Para la
realización de este estudio se utilizó un total de 16 ratones de estas dos partes se sumergió en PBS y las células
ICR con edad de 3-5 meses y de 35-40 g de peso. Los
animales se dividieron en cuatro grupos: en el primer
grupo (n=4), las mallas quirúrgicas se fijaron con puntos
simples (SUT); en el segundo grupo (n=4), se fijaron con
sellador de fibrina (SF); en el tercer grupo (n=4), las
mallas se fijaron con el sellador de fibrina en combinación
con MSCs (SF+MSCs), y en el cuarto grupo (n=4), con el
sellador de fibrina en combinación con los exo-MSCs
(SF+exos).
El modelo murino de hernia incisional se desarrolló a
partir de un modelo animal previamente descrito? (22). Los
animales se premedicaron con 2 mg/kg de meloxicam
(Metacam®, Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein,
Alemania) y 0.06 mg/kg de buprenorfina (Buprex®,
Schering-Plough, NJ, USA) por vía intraperitoneal y los
procedimientos se desarrollaron bajo anestesia inhalatoria
inducida en una cámara con isoflurano al 3% y mantenida
con isoflurano al 1.5-2.0% a través de una máscara
inhalatoria. El flujo de oxígeno se mantuvo a 0.5-1.0 l/min
durante todo el procedimiento.
Una vez anestesiados, el abdomen fue rasurado y
lavado con una solución yodada. Se realizó una incisión de
0.7-0.8 cm de longitud en cada uno de los lados del
abdomen, y se retiró un fragmento compuesto por tejido
muscular y aponeurosis de 0.6 cm de diámetro bajo cada
una de las incisiones. A continuación, se implantaron
mallas de polipropileno (Assumesh, Assut Europe, Roma,
Italia) de 1cm2 en el espacio preperitoneal sobre cada uno
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Rebeca Blázquez et al.
de los defectos creados. Estas mallas se fijaron según lo
indicado anteriormente para cada grupo. Por último, las
incisiones cutáneas se cerraron con 4-5 puntos simples de
sutura absorbible monofilamento de polidioxanona (PDSII
TM, Ethicon, Johnson & Johnson, NJ, USA).
Durante los tres primeros días tras la cirugía, los
animales recibieron 10 mg/ml de paracetamol (Apiretal®,
ERN, Barcelona, España) en el agua de bebida y 0.1
mg/kg de buprenorfina inyectada vía subcutánea cada 12
horas. Siete días tras la cirugía, los animales fueron
eutanasiados en una cámara de CO2.
2.8. Determinaciones histológicas
Tras la eutanasia de los animales, se retiraron las
mallas implantadas y se realizaron los diferentes análisis
post mortem. Para el estudio histológico, una de las dos
mallas implantadas en cada animal, junto con la piel y la
capa muscular-aponeurótica, se fijó en paraformaldehído
al 4%, se embebieron en parafina y se cortaron en láminas
de 5-8 µm de espesor. Para la visualización de las
muestras, se realizaron tinciones de hematoxilina-eosina y
tricrómico de Masson.
2.9. Estudio fenotípico del infiltrado leucocitario
La malla restante en cada animal se dividió en dos, y
para el estudio fenotípico del infiltrado de leucocitos, una
adheridas se despegaron mediante una solución de tripsina
al 0.25%. Las células recuperadas se incubaron durante 30
min a 4°C con la concentración apropiada de anticuerpos
monoclonales murinos en PBS con 2% de FBS. Las
células se marcaron con anti-CD45 murino conjugado con
PerCP (Miltenyi Biotec), anti-B220 murino conjugado con
PE (Miltenyi Biotec) y anti-Ly6C murino conjugado con
FITC (Miltenyi Biotec). A continuación, se lavaron y se
resuspendieron en PBS. El análisis por citometría de flujo
se realizó en un citómetro FACScalibur (BD Biosciences,
CA, USA) tras la adquisición de 105 eventos.
Se determinó el porcentaje de células leucocitarias
(CD45+) del total de células infiltradas y, dentro de ellas,
la expresión de Ly6C sirvió para diferenciar las
subpoblaciones de macrófagos M1 (alta expresión de
Ly6C) y M2 (baja expresión de Ly6C). Asimismo, se
determinó la subpoblación de linfocitos B activados,
correspondiente a las células B220+/Ly6C+, dentro de la
población de células leucocitarias.
2.10. Análisis de expresión génica
La mitad restante de la segunda malla implantada en
cada animal se utilizó para el análisis de expresión génica.
Para ello, se aisló el ARN total de las células adheridas a la
malla mediante TRI-Reagent (Sigma, St. Louis, MO,
USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADNc
se sintetizó a partir del ARNm mediante una reacción de
transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa
Superscript III (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Para la amplificación por PCR se utilizaron kits
comerciales de expresión génica, todos ellos de Applied
Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc. Los genes
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain