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Stem cells and their exosomes as an advanced therapy to treat incisional hernia: proof of concept in a murine model
2.2. Análisis fenotípico de las células madre
mesenquimales murinas
El análisis fenotípico de las MSCs murinas se realizó
mediante citometría de flujo. Para ello, 2×105 células se
marcaron con anticuerpos monoclonales frente a CD29,
CD44, CD90, CD105, MHC clase I y MHC clase II, y se
incubaron durante 30 min a 4°C con la concentración
apropiada de anticuerpo en presencia de PBS con 2% de
FBS. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBS.
El análisis por citometría de flujo se realizó en un
citómetro FACScalibur (BD Biosciences, CA, USA) tras
la adquisición de 105 eventos.
Las células viables se seleccionaron de acuerdo a sus
características de tamaño y granularidad (FSC/SSC) y se
analizaron con el software CellQuest (BD Biosciences,
CA, USA). El nivel de expresión de cada marcador se
expresó como la intensidad de fluorescencia relativa media
(MRFI, Mean Relative Fluorescence Intensity), que se
calculó dividiendo la intensidad de fluorescencia media
(MFI, Mean Fluorescence Intensity) por la MFI de su
control negativo. Los valores de MRFI menores de 2 se
consideraron negativos (-), los valores positivos fueron
aquellos comprendidos entre 2 y 10 (+), y los fuertemente
positivos, aquellos cuyo valor estaba entre 10 y 100 (++).
2.3. Potencial de diferenciación de las células madre
mesenquimales murinas
Los ensayos de diferenciación se llevaron a cabo
cuando las células alcanzaron el 80% de confluencia. Se
utilizaron protocolos estándar para promover la
diferenciación adipogénica, condrogénica y osteogénica de
las células. Para ello, las células se cultivaron durante 21 USA).
días con medios específicos de diferenciación (Gibco Life
Sciences, Rockville, MD, USA), que eran reemplazados
cada tres días. Transcurrido este tiempo, las células se
fijaron y se tiñeron con Oil Red O, Alcian Blue y Alizarin
Red S para evidenciar la diferenciación adipogénica,
condrogénica y osteogénica respectivamente. Las células
diferenciadas se observaron mediante microscopía óptica.
2.4. Aislamiento y purificación de los exosomas derivados
de células madre mesenquimales
Los exosomas derivados de células madre
mesenquimales (exo-MSCs) se obtuvieron a partir de
MSCs murinas de médula ósea cultivadas en frascos de
175 cm2. Cuando las células alcanzaron una confluencia
del 80%, el medio de cultivo (DMEM con 10% FBS) se
reemplazó por medio de aislamiento de exosomas (DMEM
con 1% de insulina-transferrina-selenio). Los
sobrenadantes se recogieron cada 3-4 días. Para eliminar
las células muertas y los detritus celulares, los
sobrenadantes se centrifugaron a 1 000 x g durante 10 min
y a 5 000 x g durante 20 min a 4°C, y se pasaron a través
de un filtro de 0.22 µm. Aproximadamente 15 ml de estos
sobrenadantes se ultrafiltraron mediante concentradores
Amicon® Ultra de 3 kDa de límite de peso molecular
(Merck-Millipore, MA, USA), centrifugándolos durante 60
min a 4 000 x g y obteniendo 200-300 µl de sobrenadantes
concentrados que se almacenaron a -20°C.
@Real Academia Nacional de Farmacia. Spain
2.5. Caracterización de los exosomas derivados de células
madre mesenquimales
Antes de realizar los ensayos in vivo, los sobrenadantes
concentrados se caracterizaron mediante cuantificación de
proteína total, citometría de flujo y análisis de rastreo de
nanopartículas.
La concentración de exosomas se determinó, en primer
lugar, de manera indirecta mediante cuantificación de
proteína total a través de un ensayo Bradford. Para
cuantificar la concentración de proteína, 20 µl de la
muestra de exosomas se incubaron con 180 µl de reactivo
Bradford (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) a
temperatura ambiente. Tras 5 min, se determinó la
absorbancia a 595 nm, y la concentración de proteína de
las muestras se extrapoló a partir de una curva de
concentraciones conocidas de seroalbúmina bovina.
Para el análisis mediante citometría de flujo, los
exosomas se conjugaron con microesferas de 4 µm de látex
(Aldehyde/Sulfate latex beads, Molecular probes, Life
Technologies, Carlsbad, CA, USA). Brevemente, 5 µg de
exosomas se incubaron durante toda la noche a 4°C con 10
µl de microesferas, se añadieron 110 µl de glicina 1M y,
tras 30 min de incubación, las muestras se centrifugaron,
lavaron y resuspendieron en un volumen final de 0.5 ml de
PBS con 0.5% BSA. Estas microesferas recubiertas de
exosomas se incubaron durante 30 min a 4°C con
anticuerpos monoclonales murinos anti-CD9 (BD
Biosciences, San José, CA, USA). Tras esta incubación,
las muestras se lavaron y resuspendieron en PBS con 0.5%
BSA. El análisis por citometría de flujo se llevó a cabo en
un citómetro FACScalibur (BD Biosciences, San José, CA,
Finalmente, la concentración y el tamaño de las
partículas de los concentrados se midieron mediante
análisis de rastreo de nanopartículas (NanoSight Ltd,
Amesbury, Reino Unido), que relaciona la tasa de
movimiento browniano con el tamaño de la partícula. Los
resultados se analizaron con la versión 2.2 del software de
análisis de rastreo de nanopartículas.
2.6. Preparación del sellador de fibrina y combinación con
las células madre mesenquimales y sus exosomas
El sellador de fibrina se preparó a partir de trombina
(500 IU/ml) y fibrinógeno (80 mg/ml). Estos componentes
se mezclaron a un ratio 1:1 utilizando un aplicador de
doble jeringa. Cada malla se fijó con un volumen total de
400 µl del sellador.
Para la combinación con MSCs, las células se
despegaron de los frascos de cultivo con una solución de
tripsina al 0.25%, se contaron y se ajustaron a una
concentración de 4×106 células/ml. Un total de 1.6×106
células en 400 µl de DMEM se mezclaron con trombina
(500 IU/ml) a un ratio 1:1. La suspensión células se
mezcló a continuación con fibrinógeno (80 mg/ml) a un
ratio 1:1 utilizando un aplicador de doble jeringa que
permitió la mezcla de ambos componentes. Para la fijación
de las mallas se usó un volumen de 400 µl de la solución
final (4×105 células).
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